Optimierung von Enzymen

Jun 19, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12872 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das ätherische Öl von Zanthoxylum limonella besitzt potenzielle antimikrobielle Wirkung und ist als Lebensmittelaroma und traditionelles Gewürz von großem Interesse. In dieser Studie wurde eine Enzymolyse-Vorbehandlung-Mikrowellen-unterstützte Extraktionsmethode (EP-MAE) zur Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella verwendet. Zur Optimierung der Bedingungen in der EP-MAE-Methode wurde die Response-Surface-Methodik (RSM) mit den Modellen Plackett-Burman-Design (PBD) und Box-Behnken-Design (BBD) eingesetzt. Sieben Variablen, darunter Wasser-Pflanzen-Verhältnis, Enzymmenge, Inkubationstemperatur, Inkubationszeit, Schüttelgeschwindigkeit, Mikrowellenzeit und Mikrowellenleistung, wurden ausgewählt, um die optimalen Werte für die Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella zu bestimmen. Als Ergebnis wurden vier Variablen, einschließlich Wasser-Pflanzen-Verhältnis, Enzymmenge, Mikrowellenzeit und -leistung, als signifikante Variablen bewertet, die sich auf den Ertrag und die flüchtigen Verbindungen des ätherischen Öls von Z. limonella aus PBD- und BBD-Experimenten auswirken. Die optimalen Bedingungen für EP-MAE wurden wie folgt erreicht: Wasser-Pflanzen-Verhältnis (11,16 ml/g), Enzymmenge (0,68 %), Mikrowellenzeit (36,73 Min.) und Leistung (1665 W). Die Zusammensetzung des ätherischen Öls von Z. limonella und seine Ausbeute aus EP-MAE wurden mit denen verglichen, die aus MAE und Hydrodestillation extrahiert wurden. Die optimalen Extraktionsbedingungen bei der EP-MAE-Methode führten zu einer deutlich höheren Ausbeute an ätherischen Ölen (7,89 ± 0,08 mg/g) im Vergleich zu denen, die bei MAE (7,26 ± 0,04 mg/g) bzw. Hydrodestillation (7,04 ± 0,03 mg/g) ermittelt wurden . Bei diesen Methoden wurden 51 flüchtige Komponenten identifiziert, wobei die Hauptverbindungen Limonen, β-Pinen und α-Phellandren ähnlich waren und deren Anteile zwischen 34,59–35,78 %, 19,91–22,67 % bzw. 8,47–8,75 % lagen. Allerdings wurde mit der EP-MAE-Methode ein extrem höherer Gehalt an Verbindungen nachgewiesen. Diese Studie zeigt die Bedeutung von EP-MAE, das im Vergleich zu MAE und Hydrodestillation als wirksamere Extraktionsmethode für ätherische Öle in aromatischen Pflanzen eingesetzt werden kann.

Ätherische Öle sind viskose Flüssigkeiten, die komplexe Bestandteile mit aromatischem Geruch enthalten. Sie werden seit der Antike bis heute in verschiedenen Anwendungen in der Pharma- und Naturtherapie sowie in der Lebensmittelindustrie eingesetzt1,2. Sie wurden auch als antimikrobielle und antioxidative Wirkstoffe für die Lebensmittelsicherheit eingesetzt und ersetzten chemische und synthetische Arzneimittel1,2. Im Allgemeinen wird ätherisches Öl aufgrund seiner einfachen Handhabung und geringen Kosten hauptsächlich durch Hydrodestillation gewonnen. Diese Technik verbraucht jedoch sowohl Zeit als auch Energie. Darüber hinaus führt diese Methode häufig zu geringen Ausbeuten und zur Bildung von Abbauprodukten, einschließlich wärmeempfindlicher Komponenten3. Aufgrund der hohen Nachfrage nach ätherischen Ölen besteht ein wachsendes Interesse an der Verbesserung der Erträge. Die Entwicklung neuartiger kostengünstiger und umweltfreundlicher Techniken zur Gewinnung ätherischer Öle wird gefördert. Die mikrowellenunterstützte Extraktion (MAE) ist eine neuartige und effiziente Methode zur Extraktion ätherischer Öle, die die Extraktionszeiten erheblich verkürzt und die Ausbeute an ätherischen Ölen erhöht4.

Die MAE-Technik ist weithin als umweltfreundliche und effiziente Technik zur Extraktion ätherischer Öle ohne Verwendung organischer Lösungsmittel bekannt5,6. Die Extraktion ätherischer Öle durch die MAE-Technik steht in direktem Zusammenhang mit der Wechselwirkung der Mikrowellenstrahlung mit polaren Verbindungen und Wasser, was zu erhöhten Temperaturen und Drücken in den Pflanzenzellen führt6,7. Das ätherische Öl verteilt sich leicht und schnell in der aromatischen Pflanze und reduziert so den Zeit- und Energieverbrauch7. Bei dieser Methode werden auch die Ausbeute an ätherischen Ölen und der Gehalt an flüchtigen Verbindungen erhöht. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Enzymolyse-Vorbehandlung (EP) die Ausbeute an ätherischen Ölen aus aromatischen Pflanzen verbessert, indem sie mit Extraktionstechniken wie MAE gekoppelt wird und eine hohe Effizienz, niedrige Kosten für die Enzymkonzentration, eine einfache Methode und eine freundliche Umwelt gewährleistet8,9. Bei diesem Ansatz werden verschiedene hydrolytische Enzyme verwendet, um das Zytoderm der Pflanzenzellen zu zerstören und endozelluläre Komponenten leicht freizusetzen8,9. Daher war die Verwendung einer alternativen Methode der Enzymolyse-Vorbehandlung in Kombination mit Mikrowellenbestrahlung für die Extraktion ätherischer Öle interessant und nahm schnell zu8,10.

Zanthoxylum limonella ist ein mehrjähriger Baum aus der Familie der Rutaceae. Es wird normalerweise in Südostasien angebaut11. Es wird im Allgemeinen zum Würzen von Lebensmitteln und als traditionelles Heilkraut zur Behandlung verschiedener Krankheiten wie Magen- und Zahninfektionen sowie Atemwegserkrankungen angebaut12. Die Verwendung von Z. limonella wird auch als Quelle starker antimikrobieller Wirkstoffe nachgewiesen, die als Lebensmittelzusatzstoffe mit den Hauptbestandteilen Limonen, Phellandren und Sabinen verwendet werden11,12,13. Die Hydrodestillation ist die wichtigste Technik zur Gewinnung des ätherischen Öls von Z. limonella. Der Einsatz neuer Extraktionstechnologien anstelle der herkömmlichen Hydrodestillation zur Steigerung der Ausbeute an ätherischem Z. limonella-Öl ist jedoch immer noch begrenzt. Daher wurde eine effiziente Methode mit großen ökologischen und wirtschaftlichen Vorteilen untersucht, um ätherisches Öl aus Z. limonella-Früchten zu extrahieren13.

In dieser Arbeit wurde das EP-MAE zur Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella eingesetzt und die Extraktionsbedingungen wurden mithilfe von RSM mit PBD- und BBD-Modellen optimiert. Die Ausbeute an ätherischem Z. limonella-Öl, das durch MAE und Hydrodestillation extrahiert wurde, wurde auch mit der Ausbeute verglichen, die durch die EP-MAE-Methode extrahiert wurde. Die mit allen Methoden erhaltene Zusammensetzung des ätherischen Öls von Z. limonella wurde auch mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) analysiert.

Sieben Variablen (Tabelle 1), darunter Wasser-Pflanzen-Verhältnis, Enzymmenge, Inkubationstemperatur, Inkubationszeit, Schüttelgeschwindigkeit, Mikrowellenzeit und Mikrowellenleistung, wurden verwendet, um die geeigneten Werte für die Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella zu optimieren. Alle ausgewählten Variablen, die sich auf den Ertrag des ätherischen Öls von Z. limonella auswirken, wurden mit dem PBD-Modell in zwölf Versuchsläufen bewertet (Tabelle 2). Aus dem PBD-Design wurde die Regressionsgleichung erstellt, mit der die Variablen vorhergesagt werden konnten, die die Ausbeute ätherischer Öle beeinflussten. Die Modellgleichung für die Ausbeute an Z. limonella-Öl kann wie folgt erreicht werden: Y = 1,40 + 0,05A + 0,92B + 0,01C-0,01D + 0,01E + 0,02F + 0,01G. Abbildung 1 zeigt die Bedeutung jeder Variablen anhand eines Pareto-Diagramms mit T- und P-Werten. Als Ergebnis könnte das Vorzeichen – den negativen Effekt widerspiegeln, während das Vorzeichen + der T-Werte einen positiven Effekt von Variablen auf die Extraktionsbedingung anzeigt. Die Variablen lagen über dem T-Wert-Grenzwert (3,28) und dem Bonferroni-Grenzwert (5,06) und wurden als signifikante Variablen in der EP-MAE-Methode bestimmt. Es wurde festgestellt, dass vier Variablen, darunter Mikrowellenzeit und -leistung, Enzymmenge und Wasser-Pflanzen-Verhältnis, als wesentliche Variablen für den Ertrag des ätherischen Z. limonella-Öls in der EP-MAE-Methode gelten.

Pareto-Diagramm des ätherischen Ölertrags von Z. limonella aus EP-MAE aus dem PBD-Modell mit Variablen wie (A) Wasser-Pflanzen-Verhältnis, (B) Enzymmenge, (C) Inkubationstemperatur, (D) Inkubationszeit, (E) Schütteln Geschwindigkeit, (F) Mikrowellenzeit und (G) Mikrowellenleistung.

Aufgrund von vier signifikanten Variablen, darunter Wasser-Pflanzen-Verhältnis, Enzymmenge, Mikrowellenzeit und -leistung, wurden 29 Versuchsexperimente mit dem BBD-Modell durchgeführt. Die tatsächlichen und prognostizierten Erträge sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Bedeutung jeder Variablen und des Koeffizienten (R2) sind auch in Tabelle 4 zusammengefasst. Die Modellgleichung für den Ertrag an ätherischem Z. limonella-Öl lautet Y = 6,82 + 0,34 A + 0,57B + 0,36F + 0,54G−0,17AF + 0,14AG−0,16BF−0,16BG + 0,18FG–0,26A2−0,39B2−0,21F2−0,38G2. Die Analyse mittels ANOVA für das BBD-Modell zeigte, dass das generierte Modell signifikant war (p < 0,0001) und der verbleibende Mangel an Anpassung nicht signifikant war (p = 0,1971 > 0,05). Der angepasste Koeffizient und der Korrelationskoeffizient betrugen 0,9711 bzw. 0,9855.

Dreidimensionale Diagramme und Konturdiagramme aus BBD-Ergebnissen sind in Abb. 2 dargestellt. Diese Diagramme zeigen die Auswirkungen zwischen zwei Variablen auf die Ausbeute an ätherischem Öl von Z. limonella mit den anderen beiden unabhängigen Variablen. In den Abbildungen wurde eine schwache gegenseitige Wechselwirkung festgestellt, die zu einer geringen Ausbeute an ätherischem Öl von Z. limonella führte. 2a, 2c und 2d, die die Beziehung zwischen dem Wasser-Pflanzen-Verhältnis und der Mikrowellenzeit, die Beziehung zwischen Mikrowellenleistung und Enzymmenge bzw. die Beziehung zwischen Mikrowellenleistung und Mikrowellenzeit vorhersagen, wobei eine starke gegenseitige Wechselwirkung zu einem Hoch führt Der Ertrag an ätherischem Öl von Z. limonella wurde in Abb. 2b und 2e gefunden, die die Beziehung zwischen dem Wasser-Pflanzen-Verhältnis und der Mikrowellenleistung sowie die Beziehung zwischen Mikrowellenleistung und Mikrowellenzeit veranschaulichen.

Dreidimensionale und Konturdiagramme aus dem BBD-Modell; Auswirkung zwischen Wasser-Pflanzen-Verhältnis und Mikrowellenzeit (a); Wirkung zwischen Wasser-Pflanzen-Verhältnis und Mikrowellenleistung (b); Wirkung zwischen Mikrowellenleistung und Enzymmenge (c); Wirkung zwischen Mikrowellenleistung und Mikrowellenzeit (d); und Wirkung zwischen Mikrowellenzeit und Enzymmenge (e) auf die Ausbeute an ätherischem Öl von Z. limonella.

Die Überprüfung der Modelladäquanz ist in Abb. 3 dargestellt. Das Normaldiagramm (Abb. 3a) zeigt eine gerade Linie, die die Normalverteilung unabhängig von jeder Variablen darstellt. Das Diagramm „Residuen versus Laufzahl“ (Abb. 3b) zeigt eine Zufallsverteilung mit Werten von +3 und –3, was auf die quadratische Modellkorrelation zwischen den kausalen Faktoren der EP-MAE-Methode und der Z. limonella-Ölausbeute hinweist. Die Diagramme zwischen vorhergesagten und tatsächlichen Werten sind in Abb. 3c dargestellt. Dieses Diagramm stellt eine gerade Linie dar, was darauf hindeutet, dass dieses generierte Modell erstellt wurde, um einen genauen Vergleich mit den tatsächlichen Antwortwerten vorherzusagen. Es wurde festgestellt, dass das vorgeschlagene Modell aus drei Restparzellen angewendet werden kann, um die Extraktionsmethode des ätherischen Öls Z. limonella zu optimieren.

Überprüfung der Angemessenheit des Modells, erhalten durch Normalplot (a) und Laufnummer (b) im Vergleich zu Residuen und vorhergesagtem im Vergleich zum tatsächlichen Wert (c).

Aus dem BBD-Experiment bestand die optimale Bedingung für die Extraktion von Z. limonella-Öl mit der EP-MAE-Methode aus einem Wasser-Pflanzen-Verhältnis von 11,16 ml/g, einer Enzymmenge von 0,68 %, einer Mikrowellenzeit von 36,73 Minuten und einer Leistung von 1665 W. Die vorhergesagte Ausbeute an ätherischem Z. limonella-Öl betrug 7,85 mg/g. Die unter optimalen Bedingungen erhaltenen Werte wurden in den tatsächlichen Experimenten festgelegt, um die Ausbeute an Z. limonella-Öl zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die durchschnittliche Ausbeute an ätherischem Z. limonella-Öl bei den tatsächlichen Experimenten 7,89 ± 0,08 mg/g betrug. Die erhaltenen Ergebnisse ähnelten denen des vorhergesagten Werts und demonstrierten die Präzision des generierten Modells. Darüber hinaus wurde die Ausbeute an ätherischem Z. limonella-Öl aus EP-MAE mit der Ausbeute aus MAE und Hydrodestillation verglichen. Als Ergebnis war die Ausbeute an ätherischem Z. limonella-Öl, das durch MAE und Hydrodestillation gewonnen wurde, deutlich niedriger als die durch EP-MAE ermittelte Ausbeute von 7,26 ± 0,04 mg/g bzw. 7,04 ± 0,03 mg/g.

Die flüchtigen Verbindungen in den ätherischen Ölen von Z. limonella und ihre relative Peakfläche, die durch EP-MAE, MAE und Hydrodestillation erhalten wurden, sind in Tabelle 5 aufgeführt. Bei diesen Extraktionsmethoden wurde ein ähnliches Flüchtigkeitsprofil gefunden. Insgesamt wurden 51 flüchtige Komponenten mit den gleichen Hauptverbindungen Limonen, β-Pinen und α-Phellandren identifiziert, deren Anteile zwischen 34,59 und 35,78 %, 19,91 und 22,67 %, 8,47 und 8,75 % lagen. Darüber hinaus war die Konzentration der meisten flüchtigen Komponenten, die durch EP-MAE erhalten wurden, deutlich höher als die, die durch MAE bzw. Hydrodestillation erhalten wurden. Diese flüchtigen Verbindungen bestanden aus Myrcen, α-Terpinen E-β-Ocimen, Terpinen-4-ol und Germacren D. Einige Verbindungen wie Camphen, Isoisopulegylacetat, Citronellol, Perillaalkohol und Carvacrol wiesen jedoch in allen Extraktionen ähnliche Gehalte auf Methoden.

Die Ausbeute an ätherischem Z. limonella-Öl, die durch die enzymatische Vorbehandlung mit Cellulase erzielt wurde, war deutlich höher als die Ausbeute, die mit anderen Methoden ohne Vorbehandlung erzielt wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die enzymatische Vorbehandlung mit Cellulase bei der Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella Auswirkungen auf dessen Ausbeute und die Zusammensetzung des ätherischen Öls hatte. Die Ergebnisse ähnelten denen früherer Studien, in denen beschrieben wurde, dass Cellulase die β-1,4-glykosidischen Bindungen in der Zellstruktur von Pflanzen, hauptsächlich Cellulose, hydrolysieren kann8,14,15. Mehrere Ergebnisse zeigten den Erfolg der enzymatischen Vorbehandlung mit Cellulase bei der Extraktion ätherischer Öle aus Adlerholz16, Zitrusfrüchten17, Basilikum18, Zimt8 und Lavendel9. Es wurde festgestellt, dass die Struktur der Zellwände von Z. limonella hauptsächlich durch Cellulase in der Vorbehandlung aufgebrochen und depolymerisiert wurde, was anschließend intrazelluläres ätherisches Öl in der Mischung freisetzte und zu einer höheren Ausbeute bei der Extraktion führte.

Das PBD-Experiment ergab, dass vier Variablen, darunter das Wasser-Pflanzen-Verhältnis, die Enzymmenge, die Mikrowellenzeit und die Leistung, als signifikante Variablen bewertet wurden, die sich auf den Ertrag und die flüchtigen Verbindungen des ätherischen Öls von Z. limonella auswirken, das mit der EP-MAE-Methode gewonnen wurde. Unser Ergebnis stimmte mit der Studie von Liu et al.8 überein, die berichtete, dass diese vier Faktoren die Hauptfaktoren für den Ertrag ätherischer Öle seien. Karami et al. (2015)19 berichteten, dass das Wasser-Pflanzen-Verhältnis einer der wichtigen Faktoren bei der Gewinnung ätherischer Öle war. Bei der Extraktion mit niedrigem Wasser-Pflanzen-Verhältnis kann eine unvollständige Extraktion festgestellt werden, wohingegen bei Verwendung eines hohen Wasser-Pflanzen-Verhältnisses eine komplizierte Trennung mit unerwünschten Produkten festgestellt werden kann. Die Menge des Cellulase-Enzyms wurde auch als Schlüsselfaktor für die Steigerung der ätherischen Ölausbeute durch Wechselwirkung zwischen Substraten und Enzymzellen angesehen, was zu einer Zellwandlösung führt8,20. Allerdings hing die Effizienz der Enzyme von ihren Kosten und den extrahierten Quellen ab21. Darüber hinaus hatten Mikrowellenzeit und -leistung den größten Einfluss auf den Ertrag und die flüchtigen Verbindungen des ätherischen Öls von Z. limonella. Eine längere Extraktion und eine hohe Mikrowellenleistung könnten zur Zersetzung flüchtiger Verbindungen führen, was zu einer geringeren Ausbeute des ätherischen Öls von Z. limonella führt5. Daher wurden diese vier Faktoren weiter verwendet, um die Extraktionsbedingungen in der EP-MAE-Methode zu optimieren. Diese Optimierung zielt darauf ab, Kosteneinsparungen zu erzielen, die Extraktionszeit zu verkürzen und zusammen mit den essentiellen flüchtigen Verbindungen des ätherischen Öls Z. limonella eine hohe Ausbeute zu erzielen.

Aus den BBD-Ergebnissen wurde ein hoher R2-Wert von 0,9855 für die Antwort ermittelt. Der R2-Wert ist in dieser Studie akzeptabel, da R2 höher als 0,75 ist. Der angepasste und vorhergesagte R2-Wert betrug 0,9711 bzw. 0,9251. Es kann festgestellt werden, dass das erstellte Modell mit einem P-Wert < 0,0001 und einem F-Wert über 60 äußerst signifikant war. Der F- und der P-Wert der fehlenden Anpassung zeigten einen nicht signifikanten Varianzunterschied mit einem Wert von 2,49 bzw. 0,1971 . Das vorgeschlagene Modell wies auch eine Angemessenheitsgenauigkeit von 30,38 auf, sodass dieses Modell zum Entwerfen von Variablen in der EP-MAE-Methode verwendet werden konnte. Wie bereits erwähnt, zeigten sowohl die linearen als auch die quadratischen Terme der beiden Variablen, Enzymmenge und Mikrowellenleistung, eine signifikante Bedeutung. Darüber hinaus zeigten die linearen Terme der beiden Variablen, Wasser-Pflanzen-Verhältnis und Mikrowellenzeit, eine hohe Signifikanz. Die Wechselwirkungen zwischen Wasser-Pflanzen-Verhältnis und Mikrowellenzeit sowie die Auswirkungen zwischen Enzymmenge und Mikrowellenzeit und die Wirkung zwischen Enzymmenge und Mikrowellenzeit waren hochsignifikant, während die Wechselwirkungen zwischen Wasser-Pflanzen-Verhältnis und Enzymmenge nicht signifikant waren.

Wie bereits erwähnt, könnten sich sowohl hohe als auch niedrige Wasser-zu-Pflanzen-Verhältnisse auf die Auflösung auswirken, wobei hohe Verhältnisse möglicherweise zu einer unvollständigen Extraktion führen8,20. Allerdings zerstört die Verwendung einer hohen Mikrowellenleistung wahrscheinlich die ätherischen Ölzellen, während eine niedrige Mikrowellenleistung die dielektrische Erwärmung verringern könnte22,23. Die anfängliche Bestrahlung im MAE-System könnte die Solubilisierung ätherischer Öle verbessern, während der Einsatz hoher Mikrowellenleistung Enzyme und Pflanzenmaterialien abbauen und die Ausbeute ätherischer Öle verringern könnte5,6,7. Es wurde festgestellt, dass die optimale Mikrowellenleistung in dieser Studie 1665 W betrug. Wie bereits erwähnt, hatte die hohe Leistung der Mikrowelle keinen Einfluss auf die Ausbeute an ätherischem Öl von Z. limonella. Die mit dem BBD-Modell ermittelten optimalen Bedingungen zeigten einen deutlich höheren Gehalt an allen flüchtigen Verbindungen im EP-MAE als im MAE bzw. bei der Hydrodestillation. Der extrem niedrige Gehalt dieser flüchtigen Verbindungen im Hydrodestillationsverfahren kann auf die lange Extraktionszeit zurückzuführen sein, die zu einer vollständigen Oxidation, Hydrolyse und sogar anderen Reaktionen im System führt22. Das erhaltene Ergebnis ähnelte der Studie von Liu et al.24, in der beschrieben wurde, dass der Endoborneolgehalt des ätherischen Cinnamomum-Kampferöls bei der Extraktion mit der EP-MAE-Methode im Vergleich zu den mit der MAE-Methode ermittelten Werten deutlich höher war. Dieses Phänomen kann auf die Hydrolysereaktion durch die Enzymolyse-Vorbehandlung zurückzuführen sein. Darüber hinaus zeigten einige flüchtige Verbindungen mit höherer Dipolkraft normalerweise eine drastischere Reaktion während der Mikrowellenbestrahlung, was zu einer leichteren Trennung vom Pflanzenmaterial führte6,7.

Die EP-MAE-Methode erwies sich für die Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella als erfolgreich. Die Extraktionsvariablen wurden mithilfe von RSM mit PBD- und BBD-Modellen optimiert. Es wurde festgestellt, dass vier Variablen, darunter das Wasser-Pflanzen-Verhältnis, die Enzymmenge, die Mikrowellenzeit und -leistung, als signifikante Variablen für den Ertrag und die flüchtigen Verbindungen des ätherischen Öls von Z. limonella bewertet wurden. Die optimalen Bedingungen in EP-MAE wurden wie folgt gefunden: Wasser-Pflanzen-Verhältnis (11,16 ml/g), Enzymmenge (0,68 %), Mikrowellenzeit (36,73 Min.) und Leistung (1665 W). Die Zusammensetzung des ätherischen Öls von Z. limonella und seine Ausbeute aus EP-MAE wurden mit denen verglichen, die durch MAE und Hydrodestillation erhalten wurden. Die optimalen Bedingungen der EP-MAE-Methode führten zu einer deutlichen Steigerung der Ausbeute an ätherischen Ölen (7,89 ± 0,08 mg/g) im Vergleich zu denen, die bei MAE (7,26 ± 0,04 mg/g) und Hydrodestillation (7,04 ± 0,03 mg/g) ermittelt wurden. . Die GC-MS-Analyse ergab ein unverändertes Flüchtigkeitsprofil im Vergleich zu den mit der MAE- und Hydrodestillationsmethode erhaltenen Profilen. Die wichtigsten bei allen Methoden identifizierten Verbindungen waren Limonen, β-Pinen und α-Phellandren. Insgesamt verbesserte EP-MAE die Ausbeute im Vergleich zu denen, die durch MAE bzw. Hydrodestillation erzielt wurden. EP-MAE ist eine vielversprechende Extraktionstechnik für das ätherische Öl von Z. limonella, ohne dabei die Qualität zu beeinträchtigen. Dies deutet darauf hin, dass sich sein günstiges Potenzial auch auf die Extraktion ätherischer Öle aus einer Vielzahl aromatischer Pflanzen erstrecken könnte.

Die oberirdischen Teile von Z. limonella wurden im September 2021 im Distrikt Pua, Provinz Nan, Thailand, gesammelt. Der Zugang zur Sammelstelle wurde von Frau Panid Taewa, der Farmbesitzerin, genehmigt. Das Pflanzenmaterial wurde mit Zustimmung der Mae Fah Luang Universität gesammelt. Für die Sammlung dieser Pflanze waren keine weiteren Vorschriften erforderlich. Darüber hinaus erfolgte die Sammlung des Pflanzenmaterials unter Einhaltung der einschlägigen institutionellen (Mae Fah Luang Universität), nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetze. Es wurde vom Taxonomen Dr. Jantrararuk Tovaranonte, Leiter des Botanischen Gartens Mae Fah Luang, mit einem Belegexemplar MFU 10064 identifiziert. Es wurde im Botanischen Garten Mae Fah Luang der Mae Fah Luang-Universität in Chiang Rai, Thailand, hinterlegt. Die Z. limonella-Früchte wurden 12 Stunden lang im Ofen bei 60 °C getrocknet, bevor sie bis zur Verwendung in einem Plastikbeutel bei Raumtemperatur aufbewahrt wurden. Das neutrale Cellulase-Enzym (> 10.000 U/g) wurde von Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO) gekauft. In dieser Studie wurden alle analytischen Chemikalien von Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO) verwendet.

Die EP-MAE-Extraktion bestand aus zwei Teilen, einschließlich einer enzymatischen Vorbehandlung und einer weiteren Extraktion im Mikrowellensystem. Diese Methode wurde nach der Methode von Liu et al.8 angewendet. Zunächst wurden getrocknete Z. limonella-Früchte mit einem Desintegrator (50–60 Mesh) zu einer homogenen Größe pulverisiert. Danach wurden 100 g homogenes Z. limonella-Fruchtpulver, Cellulase-Enzymlösung bei pH 5 und 10 µL 100 mg/L 2,6-Dimethylpyridin, interner Standard, gemischt und unter Verwendung eines digitalen Schüttelwasserbadoszillators weiter inkubiert (Bioevopeak, Shandong, China) wurden zuvor einem Mikrowellen-Extraktionsgerät (ETHOS™, Metrohm, Australien) unterzogen. Das überschüssige Wasser in ätherischen Ölen wurde mit wasserfreiem Na2SO4 entfernt. Die erhaltenen Z. limonella-Öle wurden in verschlossene bernsteinfarbene Fläschchen überführt und bei 4 °C aufbewahrt. Die MAE-Methode wurde unter denselben optimierten Extraktionsbedingungen wie in der EP-MAE-Methode ohne jegliche Vorbehandlung durchgeführt. Darüber hinaus wurde das ätherische Öl von Z. limonella auch durch Hydrodestillation extrahiert. Kurz gesagt, 100 g Z. limonella-Fruchtpulver und 1 l destilliertes Wasser wurden in einen Kolbenbehälter gegeben. Das ätherische Öl wurde durch Hydrodestillation mit einem Clevenger-Gerät (Apex Chemicals, Thailand) extrahiert, bis kein ätherisches Öl mehr gefunden wurde. Die Extraktionsmethode bei MAE und Hydrodestillation war die gleiche wie in EP-MAE beschrieben. Die durch MAE und Hydrodestillation gewonnenen ätherischen Öle wurden als Kontrolle im Vergleich zu den durch die EP-MAE-Methode gewonnenen ätherischen Ölen verwendet. Die Ausbeute wurde auf Basis der getrockneten Rohstoffe berechnet.

Das PBD-Modell mit sieben Variablen wurde verwendet, um Variablen zu optimieren, die die Ausbeute an ätherischem Z. limonella-Öl beeinflussen. Die Methode in dieser Studie wurde gegenüber der Studie von Liu et al.8 modifiziert. In Vorversuchen wurden die Einflüsse von sieben Variablen untersucht, um die geeigneten Bereiche für die Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella zu optimieren. Die mathematische Optimierung aller Variablen und die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Eine mathematische Polynomgleichung erster Ordnung: Y = β0 + ∑βi + Xi, wobei Y die prozentuale Ausbeute und β0 und βi der Augenblick für die Konstanten des Achsenabschnittsterms ist bzw. der Regressionskoeffizient. Sieben verschiedene und unabhängige Variablen, darunter Wasser-Pflanzen-Verhältnis, Enzymmenge, Inkubationstemperatur, Inkubationszeit, Schüttelgeschwindigkeit, Mikrowellenzeit und Leistung, wurden untersucht, um die vergleichsweise signifikanten Variablen für die Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella (Reaktion) zu bewerten. Alle unabhängigen Variablen sind in Tabelle 2 aufgeführt und sind mit − 1 und + 1 für niedrige und hohe Werte mit zwölf Experimenten ausgelegt. Der durchschnittliche Ertrag an ätherischem Z. limonella-Öl aus jedem Experiment wurde mit der Software Design Expert 13 berechnet.

Das BBD-Modell wurde auch verwendet, um die Extraktionsbedingungen in der EP-MAE-Methode mit den unabhängigen Faktoren bei der Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella zu optimieren. Drei Stufen jeder Variablen wurden ausgewertet und als niedrig, mittel und hoch dargestellt. Neunundzwanzig Experimente wurden mit der Software Design Expert 13 entworfen und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die Extraktion des ätherischen Öls von Z. limonella wurde durch die folgende Polynomgleichung zweiter Ordnung bewertet und die tatsächliche Ausbeute an ätherischem Öl wurde durch ermittelt Multiregressionsanalyse. Y = β0 + ∑3 i = 1 βiXi + ∑3 i = 1 βiiX2 i + ∑2 i = 1 ∑3 j = i + 1 βijXiXj wobei Y die durchschnittliche Ausbeute an ätherischem Öl von Z. limonella ist. β0, βi, βii und βij sind die entsprechenden Regressionskoeffizienten der Intercept-, linearen, quadratischen und interaktiven Terme; und Xi und Xj sind die codierten unabhängigen Variablen.

Ein Agilent 6890 N-Gaschromatograph, verbunden mit einem massenselektiven Elektronenstoßionisationsdetektor (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Zur Trennung flüchtiger Verbindungen wurde eine Quarzglaskapillare DB5-MS (J&W Scientific, USA) mit einem Durchmesser von 30 m × 0,25 mm Innendurchmesser und 0,25 µm eingesetzt. Durch alle Extraktionsmethoden gewonnene ätherische Öle wurden mit Hexan im Verhältnis 1:100 v/v verdünnt. Jede Probenlösung (1,0 µL) wurde im Split-Modus (Split-Verhältnis 1:50) in die Injektionsöffnung des GC-MS-Geräts injiziert. Als Trägergas wurde Heliumgas mit einer Geschwindigkeit von 1,0 ml/min verwendet. In dieser Arbeit wurde der Elektronenstoßionisationsmodus mit Injektor, Ionenquelle und einer Grenzflächentemperatur von 250 °C verwendet. Die programmierte Temperatur wurde mit einer Anfangstemperatur von 60 °C verwendet und dann mit einer Geschwindigkeit von 3 °C/min auf 220 °C erhöht. Die flüchtigen Verbindungen wurden mithilfe der MassHunter Acquisition-Software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) identifiziert, indem ihre Massenspektren mit denen aus den Wiley7N- und W8N08- und Adams-Bibliotheken verglichen wurden25. Die Retentionsindizes aller flüchtigen Verbindungen wurden ebenfalls in Korrelation zu denen der C9-C16-n-Alkane berechnet. Die relativen Gehalte der identifizierten Verbindungen wurden als Verhältnisse ihrer Peakflächen zu den Peakflächen des internen Standards (2,6-Dimethylpyridin) berechnet.

In PBD- und BBD-Experimenten wurde die Software Design Expert 13 (Stat-Ease, Minneapolis, USA) eingesetzt. Jedes Experiment wurde für fünf Wiederholungen durchgeführt. Die Daten wurden als Durchschnittswerte dargestellt. Die Varianzanalyse (ANOVA) wurde angewendet, um die Signifikanz des ätherischen Ölertrags und der flüchtigen Profile aller Proben zu bestimmen. Alle Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung angezeigt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Die Autoren danken dem Medical Plant Innovation Center der Mae Fah Luang University für die Bereitstellung von MAE in dieser Studie. Diese Arbeit wurde von der Mae Fah Luang Universität finanziell unterstützt.

School of Science, Mae Fah Luang Universität, Chiang Rai, 57100, Thailand

Sarunpron Khruengsai, Nittirat Promhom, Teerapong Sripahco, Piyanuch Siriwat und Patcharee Pripdeevech

Zentrum für chemische Innovation für Nachhaltigkeit (CIS), Mae Fah Luang Universität, Chiang Rai, 57100, Thailand

Patcharee Pripdeevech

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SK, NP und TS führten Experimente durch. SK und NP führten eine GC-MS-Analyse durch und analysierten die Daten. PS hat auch Daten analysiert. SK und PP haben das Manuskript geschrieben und überprüft. PP überwachte die Arbeiten.

Korrespondenz mit Patcharee Pripdeevech.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Khruengsai, S., Promhom, N., Sripahco, T. et al. Optimierung der enzymunterstützten Mikrowellenextraktion des ätherischen Öls Zanthoxylum limonella mithilfe der Reaktionsoberflächenmethode. Sci Rep 13, 12872 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40142-4

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Eingegangen: 16. Mai 2023

Angenommen: 05. August 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40142-4

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