Nicht

Oct 27, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12339 (2023) Diesen Artikel zitieren

624 Zugriffe

11 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Der Transport von interstitieller Flüssigkeit und gelösten Stoffen spielt eine entscheidende Rolle bei der Beseitigung von Stoffwechselabfällen aus dem Gehirn. Es wurde gezeigt, dass die transkranielle Anwendung von fokussiertem Ultraschall (FUS) die lokalisierte Aufnahme gelöster Liquorstoffe in das Gehirnparenchym fördert; Seine Auswirkungen auf den Transport und die Clearance interstitieller gelöster Stoffe sind jedoch weiterhin unbekannt. Wir zeigen, dass die gepulste Anwendung von FUS niedriger Intensität auf das Rattenhirn den Transport von intrakortikal injizierten fluoreszierenden Tracern (Ovalbumin und Dextran mit hohem Molekulargewicht) verbessert, was zu einer größeren parenchymalen Tracer-Volumenverteilung im Vergleich zur nicht beschallten Kontrollgruppe führt (Ovalbumin um 40,1 %). Dextran um 34,6 %). Darüber hinaus förderte FUS die Drainage von injiziertem interstitiellem Ovalbumin sowohl in die oberflächlichen als auch in die tiefen Halslymphknoten (cLNs) ipsilateral zur Beschallung, wobei in den oberflächlichen cLNs im Vergleich zur nicht beschallten Hemisphäre eine um 78,3 % höhere Drainage beobachtet wurde. Die Anwendung von FUS erhöhte den Grad des Transports gelöster Stoffe, der von der dorsalen Gehirnoberfläche aus sichtbar ist, mit einer um etwa 43 % größeren Fläche und einer um etwa 19 % höheren Fluoreszenzintensität als bei der nicht beschallten Gruppe, insbesondere auf der Pialoberfläche ipsilateral zur Beschallung. Die Beschallung löste keine neuronale Erregung auf Gewebeebene aus, gemessen durch ein Elektroenzephalogramm, und veränderte auch nicht das Molekulargewicht der Tracer. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht-thermisches transkranielles FUS den advektiven Transport interstitieller gelöster Stoffe und deren anschließende Entfernung auf völlig nicht-invasive Weise verbessern kann, was seinen potenziellen nicht-pharmakologischen Nutzen bei der Erleichterung der Beseitigung von Abfallstoffen aus dem Gehirn bietet.

Das Lymphsystem spielt eine wichtige Rolle beim Transport/Abtransport von Stoffwechselnebenprodukten und Abfallprodukten aus dem Körper, die von weit über die Organe verteilten Netzwerken von Lymphgefäßen gesammelt werden. Dem Zentralnervensystem (ZNS) fehlen jedoch spezielle Lymphgefäße im neuronalen Parenchym, während die relativ hohe Stoffwechselrate neuronaler Zellen und ihre hohe Anfälligkeit gegenüber Veränderungen in der extrazellulären Umgebung eine effiziente Abfallbeseitigung für eine normale Funktion erfordern. Studien haben über Zusammenhänge zwischen einer fehlerhaften Beseitigung von Hirnabfällen und Demenz und der Alzheimer-Krankheit (AD)1,2 sowie mit dem Altern3,4 berichtet. Auf dieser Grundlage haben die Mechanismen der Lymphfunktion des ZNS großes Forschungsinteresse geweckt.

Das Gehirn und das Rückenmark sind von der Liquor cerebrospinalis (CSF) umgeben, die hauptsächlich vom Plexus choroideus produziert wird, der die Hirnventrikel auskleidet5. Der Raum zwischen neuronalen Zellen einschließlich der extrazellulären Matrix (d. h. der interstitielle Raum) enthält interstitielle Flüssigkeit (ISF), die in ihrer Zusammensetzung CSF6 ähnelt. Der gegenseitige Austausch von Flüssigkeiten und gelösten Stoffen zwischen ISF und CSF, die beide durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und die Blut-CSF-Schranke (B-CSF) vom Blutkreislauf getrennt sind, ist wichtig für die Beseitigung von Abfallstoffen und Stoffwechselnebenprodukten aus dem Gehirn Dies wird durch verschiedene Mechanismen vermittelt, darunter Diffusion, Ionenkanaltransport und durch hydrostatischen/osmotischen Druck gesteuerten Transport7,8,9. Was die Mechanismen anbelangt, die interstitielle gelöste Stoffe durch das dichte Neuropil bewegen, wurden der durch den Astrozyten-Aquaporin-4 (AQP4)-Kanal vermittelte Wassertransport (bekannt als „glymphatischer“ Transport)7,10 und die Diffusion gelöster Stoffe innerhalb des ISF11,12 identifiziert die wichtigsten Einflussfaktoren. Auch physiologische Faktoren wie Schlaf und körperliche Aktivität beeinflussen den Transportgrad; Beispielsweise hat sich gezeigt, dass Schlaf im Slow-Wave-Stadium den interstitiellen Raum vergrößert13, während freiwilliges Radlaufen den glymphatischen Transport bei Mäusen steigert14.

Neben den Beiträgen des AQP4-vermittelten Wassertransports und der passiven Diffusion gelöster Stoffe ist der konvektive CSF-Massenfluss entlang des perivaskulären Raums (PVS) ein weiteres wichtiges Transportelement, um gelöste Stoffe vom Gehirn wegzutreiben. Das PVS kleidet das Gehirngefäßsystem in einem komplizierten Netzwerk aus und dient als wichtiger Durchgang für den CSF-Transport, wobei durch arterielle Pulsation erzeugte Druckgradienten (auch als „perivaskuläres Pumpen“ bezeichnet)15,16 einen konvektiven CSF-Fluss und eine begleitende advektive Bewegung gelöster Stoffe erzeugen Dies erleichtert auch die interstitielle/CSF-Bewegung gelöster Stoffe auf AQP4-unabhängige Weise 11,17,18. Kürzlich ergab eine Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebungsstudie eindrucksvolle visuelle Beweise für die advektive Bewegung exogener Partikel durch das PVS neben den Pialarterien bei Mäusen19. Obwohl die genauen Wege noch intensiv erforscht werden, ist bisher klar, dass die gelösten Stoffe/Abfälle das Gehirn über verschiedene Wege verlassen, wie z. B. die Arachnoidalgranulation (Austritt in die meningealen Venennebenhöhlen), die Nasenschleimhaut oder die meningealen Lymphgefäße (Austritt in den Gebärmutterhals). Lymphknoten)6,9.

Die kontrollierte Modulation des homöostatischen Transports von gelösten Stoffen im Gehirn durch die Regulierung der AQP4-Aktivitäten oder die Förderung der passiven Diffusion der gelösten Stoffe im Liquor wäre mit der derzeit verfügbaren Technologie äußerst schwierig. Es ist jedoch möglich, einen druckgesteuerten konvektiven Massenfluss im Gehirn zu erzeugen, was uns dazu veranlasste, nach einer nicht-invasiven Technik zu suchen, die den Transport und die Beseitigung interstitieller gelöster Stoffe aus dem Gehirn verbessert. Durch die Anwendung von Ultraschallwellen werden nicht-thermische Strahlungskräfte auf das Zielmedium ausgeübt, die einen gerichteten Fluss induzieren. Dieses als akustischer Streaming-Effekt bekannte Phänomen wurde zur Abgabe von Infusionen an das Gehirn angewendet, indem im Rahmen der konvektionsverstärkten Abgabe eine Ultraschallquelle in die Injektionsnadel/Kanüle integriert wurde20,21. Raghavan schlug theoretisch die Verwendung von akustischem Streaming vor, um die advektive Bewegung verschiedener gelöster Stoffe im Gehirn auf nicht-invasive Weise zu fördern22.

Fokussierte Ultraschalltechniken (FUS) können mithilfe der Ultraschallwandlergeometrie, einer akustischen Linse oder durch Betätigung eines Mehrelementwandlers konvergierte akustische Druckwellen an interessierende biologische Gewebe abgeben23. Die Verwendung eines niedrigen Ultraschallfrequenzbereichs (in der Größenordnung von 200–700 kHz, also niedriger als bei der Ultraschallbildgebung) ermöglicht die Ultraschallübertragung durch den intakten Schädel auf völlig nicht-invasive Weise24. Mit seiner hervorragenden räumlichen Selektivität und Tiefeneindringung in das Gehirn wurde die transkranielle FUS (tFUS) in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, beispielsweise bei der Ablation von Gehirngewebe mithilfe von hochintensivem Ultraschall25 und der Modulation regionaler Gehirnfunktionen durch nichtthermische Niederintensität26 und Abgabe von Arzneimitteln mit hohem Molekulargewicht (MW) an das Gehirn durch Störung der Blut-Hirn-Schranke in Kombination mit Mikrobläschen-Kontrastmitteln27.

Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass die gepulste Anwendung von FUS niedriger Intensität durch den Rattenschädel den Transport von CSF-Tracern (intrasternal injiziertes Ovalbumin, OA) verbessern und Arzneimittelmoleküle mit hohem Molekulargewicht (Panitumumab; 150 kDa MW) an regionsspezifisches Hirngewebe abgeben kann. ohne die BBB28,29 zu stören. Diese Studien boten ein vielversprechendes Potenzial von tFUS zur Verbesserung des CSF-Transports gelöster Stoffe. Es bleiben jedoch offene Fragen, ob es den Transport sowie die Clearance intrakortikal injizierter gelöster Stoffe aus dem Gehirn verbessern kann. Um diese Fragen zu beantworten, injizierten wir fluoreszierende Tracer für gelöste Stoffe mit unterschiedlichem MW (45 kDa OA und 2000 kDa Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran, FITC-d) in die Hirnrinde der Ratte und wendeten nicht-thermisches FUS niedriger Intensität auf die Stelle an Injektion. Anschließend wurde das Ausmaß der durch die Beschallung beeinflussten Tracerverteilung untersucht. Um außerdem zu untersuchen, ob FUS die Clearance interstitieller gelöster Stoffe aus dem Gehirn verbessern kann, führten wir ein separates Experiment durch, um den Grad der durch FUS geförderten OA-Drainage zu den zervikalen Lymphknoten (cLNs) zu quantifizieren.

Der experimentelle Ablauf ist in Abb. 1a dargestellt. Nach Freilegen der Dura durch ein durch den Schädel gebohrtes Bohrloch wurden 0,5 µL Texas Red OA mit 45 kDa und FITC-d mit 2000 kDa, getrennt konstituiert in einer Konzentration von 0,5 Gew.-% in künstlichem CSF (aCSF), intrakortikal injiziert (3 mm rechts und 1 mm). mm kaudal zum Bregma, 2 mm Tiefe) an männliche Sprague-Dawley-Ratten (n = 28) unter Ketamin- und Xylazin-Anästhesie. Um die Auswirkungen der Aggregation von OA in einer FITC-d-Lösung zu verhindern, wurden die Tracer getrennten Tiergruppen (jeweils n = 14) injiziert.

Transport intrakortikaler Fluoreszenztracer. (a) Die schematische Darstellung tierexperimenteller Verfahren (Startzeit = 0 min in Bezug auf das Einführen der Nadel). Der blaue Kegel veranschaulicht das akustische Strahlprofil des FUS-Wandlers. (b) Darstellung des Ultraschall-Pulsschemas. (c) Das akustische Druckprofil entlang der Längsachse zur Beschallung (links) und der Querebene im Fokus (rechts). Der Pfeil gibt die Beschallungsrichtung an. Ein akustisches Fokusprofil, das bei vollem Druck bei 90 % Maximaldruck (FW90 % M) gebunden ist, wird durch die weiße gepunktete Linie dargestellt und das Profil des Drucks in voller Breite bei halbem Maximum (FWHM) wird durch dargestellt schwarze gepunktete Linie (Balken = 10 mm). (d) Beispielhafte OA- und FITC-d-Verteilungen einer Ratte. 0 mm auf der x-Achse bezeichnet die Injektionsstelle, während eine positive Richtung der Achse die rostrale Richtung angibt. (e) Scheibenspezifische Volumenverteilungen von OA und (f) FITC-d-Tracer. Die schattierten Bereiche stellen die Schnitte dar, die einen signifikanten Unterschied (P < 0,05) zwischen den FUS +- und FUS−-Bedingungen (jeweils n = 7) zeigen. Fehlerbalken: Standardfehler des Mittelwerts (SEM).

FUS, das bei 200 kHz arbeitet, wurde dann 30 Minuten nach dem Herausziehen der Nadel gepulst (100 ms Pulsdauer (PD) und 1 Hz Pulswiederholungsfrequenz (PRF)) stereotaktisch für 30 Minuten mit einem räumlichen Spitzenwert an die Injektionsstelle abgegeben Pulsdurchschnittsintensität (ISPPA) von 5 W/cm2 (10 % Arbeitszyklus, 500 mW/cm2 räumliche Peak-Zeit-Durchschnittsintensität – ISPTA) (das Pulsschema wurde in Abb. 1b dargestellt). Der Satz von Pulsierungsparametern, einschließlich der akustischen Intensität, wurde auf der Grundlage der Parameter ausgewählt, die nachweislich den Transport gelöster CSF-Stoffe bei Ratten verbessern, ohne Gewebeschäden hervorzurufen oder die Blut-Hirn-Schranke28 zu stören. Die Verwendung einer Frequenz von 200 kHz eignet sich für die transkranielle Abgabe von Ultraschall beim Menschen, da im Vergleich zur Verwendung höherer Frequenzen der Verlust akustischer Energie beim Einführen in den Schädel geringer ist30. Der Druck am Fokus, gemessen in entgastem Wasser, betrug 770 kPa (Spitze-zu-Spitze-Amplitude) mit einem entsprechenden mechanischen Index (MI) von 0,86, was viel niedriger war als der gesetzliche Grenzwert von 1,9, der derzeit für die Diagnose festgelegt ist Ultraschallbildgebung von Organen ohne Gaskörper bei Erwachsenen31. Ein akustischer Fokus mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Länge von 15 mm wurde durch das Profil definiert, das bei einem maximalen Druck von 90 % über die gesamte Breite gebunden war. Bei voller Breite bei halbem Maximum (FWHM) betrug die akustische Fokusgröße 7 mm im Durchmesser und 27 mm in der Länge (Abb. 1c). Der maximale Druck innerhalb des Fokus bildete sich 11 mm von der Austrittsebene des Wandlers entfernt, und die Mitte des Fokus wurde mithilfe eines 3-Achsen-Robotertischs auf die Koordinaten der Injektion platziert.

Das Gewicht der Tiere war in den Gruppen gleichgültig (Kruskal-Wallis-H-Test; χ2(3) = 1,06, P = 0,79). Da Herzfrequenz und Narkosetiefe bekanntermaßen Faktoren sind, die den Liquortransport beeinflussen19,32, wurden zu Beginn der Versuchsbedingungen alle 15 Minuten die Herz-/Atemfrequenz sowie die periphere Sauerstoffsättigung (SpO2) gemessen. Diese Variablen änderten sich im Laufe der Zeit nicht und unterschieden sich nicht zwischen den Bedingungen (alle P > 0,06, Ergänzungstabelle S1).

Fluoreszenzbilder von 200 µm dicken Hirnschnitten, die die Injektionsstelle umfassen, zeigten, dass intrakortikal injiziertes OA und FITC-d durch FUS (bezeichnet als „FUS +“) im Vergleich zur nicht beschallten Kontrollgruppe in eine größere Entfernung von der Injektionsstelle transportiert wurden ( 'FUS−') (die durch die Pfeilspitzen angezeigten Bereiche in Abb. 1d). Basierend auf der Analyse des Verteilungsvolumens von OA ergaben die FUS-Bedingungen eine um 40,1 % höhere OA-Dispersion im Vergleich zur unbeschallten Kontrollbedingung (FUS +: FUS− = 32,5 ± 6,8: 23,2 ± 4,1 µL, Mittelwert ± Standardabweichung, einseitig, Mann –Whitney-Test, Z-Score (Zs) = 2,36, U = 43,5, P = 0,009). In ähnlicher Weise wurde eine um 34,6 % größere FITC-d-Verteilung im FUS-Zustand beobachtet (FUS +: FUS− = 3,5 ± 0,4: 2,6 ± 0,6 µL, einseitig, Mann-Whitney-Test, Zs = 2,56, U = 45, P = 0,005). Innerhalb jeder Bedingung (FUS + oder FUS−) war das OA-Verteilungsvolumen größer als FITC-d, was auf das Vorhandensein eines größenabhängigen Transports hinweist, der den Transport von OA mit kleinem MW begünstigt (einseitig, Mann-Whitney-Test, Zs =). 3,4, U = 49, P = 0,0002 innerhalb des FUS + und Zs = 3,07, U = 49, P = 0,001 innerhalb des FUS-).

Die Fluoreszenzbilder von zusammenhängenden Gehirnschnitten der Tiere wurden in Bezug auf die Injektionsstelle ausgerichtet und das Tracervolumen mithilfe automatisierter Kriterien geschätzt (beschrieben unter „Erfassung und Analyse von Fluoreszenzbildern“ im Abschnitt „Materialien und Methoden“). Schichtweise Vergleiche zwischen dem Volumen der OA- und der FITC-d-Aufnahme (in µL, dargestellt in Abb. 1e bzw. f) spiegelten auch ein erhöhtes Volumen beider Tracer durch die Anwendung von FUS wider, wobei der Unterschied stärker ausfiel die rostrale Seite von der Injektionsstelle (schattierte Bereiche zeigen die Schnitte an, die ein größeres Tracervolumen in FUS + bei P < 0,05 zeigen, einseitiger Mann-Whitney-Test). Wir fanden jedoch keine nennenswerte ventrale Richtungsverzerrung von der Injektionsstelle (entlang der Richtung der akustischen Ausbreitung), wo der Transport des Tracers radial zur Injektionsstelle erfolgte. In der Kontrollbedingung (FUS-) zeigten beide Tracer eine symmetrischere Verteilung um die Injektionsstelle.

Da der interstitielle Transport von FITC-d mit hohem MW auch bei Anwendung von FUS begrenzt war (basierend auf den Ergebnissen des ersten Studienabschnitts), wurde in der nachfolgenden Studie zur Beurteilung der interstitiellen Tracer-Clearance zu den cLNs nur OA verwendet. Um die Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion in den cLNs zu erhöhen, wurden SD-Ratten (n = 16) 2 µL OA mit höherer Konzentration (1 Gew.-%) in aCSF an derselben Stelle injiziert. Die hemisphärische Seite der Injektion wurde randomisiert und ausbalanciert. Nach einer Wartezeit von 30 Minuten nach dem Zurückziehen der Nadel wurde FUS 1 Stunde lang an die Injektionsstelle abgegeben, um die Clearance von OA aus dem Gehirn zu den cLNs zu ermöglichen (FUS +, n = 8, dargestellt in Abb. 2A, mit Ableitungswegen gelöster Stoffe). zu den cLNs). Der Rest der Tiere (n = 8) erhielt keine Ultraschallbehandlung, was die Kontrollbedingung (FUS−) darstellte. Das Gewicht der Tiere war zwischen den Gruppen gleichgültig (zweischwänziger Mann-Whitney-Test, Zs = 0,47, U = 27, P = 0,64). Die Herz-/Atemfrequenz sowie die Werte der peripheren Sauerstoffsättigung (SpO2) blieben im Laufe der Zeit unverändert und variierten nicht zwischen den FUS-Bedingungen (alle P > 0,25, Ergänzungstabelle S2).

Transport von intrakortikal injiziertem Ovalbumin-Tracer. (A) Darstellung der Entwässerung gelöster Stoffe zum tiefen cLN (dcLN) und oberflächlichen (scLN) durch die Anwendung von FUS. Gestrichelte Linien markieren die möglichen Entwässerungswege. (B) Beispiele für Fluoreszenzbilder von der Rückenoberfläche zwischen FUS+- und FUS−-Bedingungen und (C) entsprechendes Fluoreszenzbild ipsilateral zur Injektionsstelle, OB: Riechkolben, Crbl: Kleinhirn, MCA: mittlere Hirnoberflächenarterie (angezeigt durch Pfeilspitzen). ), CRV: kaudale Rhinal-Pia-Oberflächenvene (angezeigt durch Pfeile), Balken = 5 mm. Die gelben quadratischen Bereiche wurden im Graustufenbild rechts vergrößert. (D) Beispielhafte OA-Verteilungen der Hirnschnitte zwischen den FUS+- und FUS-Bedingungen, Balken = 5 mm. (E) Scheibenspezifische Volumenverteilungen von OA. 0 mm auf der x-Achse bezeichnet die Injektionsstelle, während + die rostrale Richtung angibt. Die rosa schattierten Bereiche stellen die Schnitte dar, die einen signifikanten Unterschied (P < 0,05) zwischen den Bedingungen (jeweils n = 8) zeigen. (F) Vergleiche der Fläche der OA-Verteilung (in mm2) und der Fluoreszenz (in willkürlichen Einheiten, au) zwischen FUS +- und FUS−-Bedingungen. Die Kreise geben die Einzelwerte von 8 Tieren an.

Wir fanden eine größere OA-Volumenverteilung anhand der Bildgebung der dorsalen Gehirnoberfläche (ein Beispiel in Abb. 2B, alle Bilder in der ergänzenden Abb. S1). Die Fluoreszenzbildgebung der lateralen Oberfläche der Tracer-Injektion spiegelte auch eine breitere OA-Verteilung wider, die durch die Beschallung beeinflusst wurde, wobei OA an der Seite der pialen Oberflächengefäße angrenzte, zu denen die mittlere Hirnarterie (MCA) und die kaudalen Rhinalvenen (CRV) gehören (Abb . 2C, angezeigt mit Pfeilspitzen bzw. Pfeilen, n = 5, dargestellt in der ergänzenden Abbildung S2).

Die Untersuchung von Hirnschnittbildern ergab, dass ein größeres Volumen (d. h. 2 µL) und eine längere Beschallungs-/Überwachungszeit (60 Min.) eine breitere OA-Aufnahme in das Hirnparenchym ergaben, die ± 3 mm rostral/kaudal der Injektionsseite umfasste (Abb . 2D). Die Anwendung von FUS führte zu einer größeren Volumenverteilung von OA im Vergleich zu den nicht ultraschallbehandelten Kontrollen, wobei das Verteilungsvolumen von OA ~ 125 % größer war als das der Kontrolle (FUS + : FUS− = 173,9 ± 59,8: 77,2 ± 64,57 µL, Mann Whitney Test, einseitig, Zs = 1,93, U = 40, P = 0,026). Schichtweise Vergleiche des Tracervolumens (in µL) zeigten, dass die Ultraschallbehandlung den interstitiellen Transport des OA mit räumlicher Ausrichtung in Richtung der rostralen Richtung der Injektionsstelle verstärkte (Abb. 2E, schattierter Bereich, bei P < 0,05, einseitig). Mann-Whitney-Test). Dieses größere Volumen der Traceraufnahme wurde durch Bilder der dorsalen Gehirnoberfläche gestützt, die eine um etwa 43 % größere Fläche zeigten (FUS +: FUS− = 8,6 ± 1,4: 6,0 ± 2,4 mm2, einseitig, Mann-Whitney-Test, Zs = 2,36, U =). 55, P = 0,009) sowie ~ 19 % höhere Fluoreszenzintensität (FUS + : FUS− = 174,2 ± 14,3: 146,6 ± 24,4 au, einseitig, Mann-Whitney-Test, Zs = 2,43, U = 55, P = 0,007, Abb. 2F).

Die Anzahl (zwischen 3 und 6) und die Fläche (33,1–77,5 mm2) der Lymphknoten waren zwischen FUS + und FUS- Zuständen sowie zwischen den Injektionsseiten gleichgültig (zweiseitiger Mann-Whitney-Test, alle P > 0,05). , detaillierte Informationen in der Ergänzungstabelle S3 und Abb. S3). Die Anwendung von FUS führte zu einer höheren OA-Aufnahme in den cLNs (Beispielbild in Abb. 3a), während die prozentuale Aufnahme im tiefen cLN (dcLN) niedriger war als im oberflächlichen (scLN) (einseitiger Mann-Whitney-Test). , Zs = 6,23, U = 54, P < 0,001). Im FUS+-Zustand war der Bereich der OA-Aufnahme im dcLN auf der ipsilateralen Seite zur Beschallung (IL, 1,4 ± 1,8 %) signifikant größer als auf der kontralateralen Seite (CL, 0,5 ± 0,6 %; Abb. 3b, eins). -tailed, Wilcoxon Signed-Rank-Test, Zs = 1,76, P = 0,039, n = 8) sowie die der Seite kontralateral zur Injektion während der Kontrollbedingung (FUS−, 0,4 ± 0,9 %, one-tailed, Mann-Whitney). Test, Zs = 1,96, U = 53, P = 0,02). Dieser Unterschied wurde jedoch in Bezug auf die OA-Aufnahme in dcLN ipsilateral zur Injektion der Kontrolltiere nicht beobachtet (0,5 ± 0,9 %, zweiseitig, Mann-Whitney-Test, Zs = 1,21, U = 44, P = 0,23).

Drainage des intrakortikal injizierten Ovalbumin-Tracers in die Halslymphknoten. (a) (obere Reihe) Hellfeldbilder extrahierter cLNs unter FUS +- und FUS−-Bedingungen und (untere Reihe) entsprechende Fluoreszenzbilder überlagert mit OA-Schwellenwertfluoreszenz (in Rot). Die Kontur von dcLN ist durch eine gelbe gepunktete Linie markiert, während scLN durch weiße gepunktete Linien markiert ist. IL: Ipsilateral zu FUS/Injektionsstelle, CL: Kontralateral zu FUS/Injektionsstelle. Stab = 5 mm. (b) Die prozentuale Fläche der OA-Fluoreszenz der dcLNs und (c) der scLNs, gemessen unter den Bedingungen FUS + und FUS− (jeweils von n = 8 Tieren). Die schwarze Linie zeigt P < 0,05 beim Wilcoxon Signed-Rank-Test an und graue Linien zeigen P < 0,05 beim Mann-Whitney-Test an.

Bei scLN führte FUS zu einer um 78,3 % höheren Aufnahme von OA auf der injizierten Seite (23,7 ± 5,2 % Fläche, Abb. 3c) im Vergleich zur kontralateralen Seite (13,3 ± 6,6 %; einseitig, Wilcoxon-Signed-Rank-Test, Zs = 2,42). , P = 0,008, n = 8). Der Grad der OA-Aufnahme war auch höher als bei beiden Seiten von scLN, die aus der Kontrollbedingung erhalten wurden (FUS−, IL: CL = 14,0 ± 7,6: 10,8 ± 12,2 %, einseitig, Mann-Whitney-Test, Zs = 2,56, U =). 56, P = 0,005 bzw. Zs = 1,96, U = 51, P = 0,02). Innerhalb der Kontrollbedingung (FUS-) gab es keinen Unterschied in der prozentualen Fläche der OA-Aufnahme zwischen den Seiten der OA-Injektion (zweiseitiger Wilcoxon-Signed-Rank-Test, Zs = 0,2, P = 0,2, n = 8). Wir stellen fest, dass die Traceraufnahme sowohl in dcLN als auch in scLN große Unterschiede in der OA-Drainage innerhalb der Gruppe aufwies, insbesondere in dcLN, wo bei einigen Tieren keine offensichtliche OA-Drainage festgestellt wurde.

Da die Verwendung eines bestimmten akustischen Parameters auch das Gehirn stimulieren kann26,33,34, wurde das EEG an einer separaten Gruppe von Tieren (n = 9, Gewicht = 285,7 ± 10,5 g) gemessen, um zu bewerten, ob die angewandte Beschallung zu einer neuronalen Aktivierung führte. Es wurde festgestellt, dass die Ultraschallbehandlung keine von der Kontrollbedingung unterscheidbaren EEG-Peaks hervorrief (zweiseitiger t-Test, t-Score < 1,49; P > 0,16 über alle Zeitpunkte hinweg) und die Signalamplituden innerhalb des Rauschniveaus blieben (± 3). µV; Abb. 4a), was auf das Fehlen einer durch Ultraschall induzierten Hirnstimulation hinweist.

Bewertung der EEG-Merkmale der Ratten, Molekulargewicht der Tracer und Bewertung der thermischen Wirkung von FUS. (a) Gemitteltes EEG, erfasst im FUS-Zustand (FUS +; rote Linie) und ohne Beschallung (FUS−; blaue Linie), über einen Zeitraum von 100 ms vor Beginn der Beschallung bis 700 ms danach. Der schattierte Bereich gibt den Standardfehler (n = 9) an und das graue Feld gibt die Dauer der Beschallung (100 ms) an. Es gab keinen statistischen zeitlichen Spannungsunterschied zwischen den beiden Bedingungen. (b) Gelelektrophorese von OA und FITC-d. Die Elution jedes Tracers wurde im gleichen Sichtfeld mit automatischer Belichtung fotografiert und mit Leerzeichen beschnitten. Unbeschnittene Gelfotos in voller Länge sind in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt. (c) Eine pseudofarbige Karte der akustischen Intensität, normalisiert in Bezug auf den aus der numerischen Simulation erhaltenen Maximalwert, wurde in Dreiebenen des akustischen Fokus angezeigt (erhalten von einem Rattenschädel, umrandet in einem weißen Schädelprofil). Das Profil des Wandlers wird durch die rote Linie markiert. Stab = 5 mm. (d) Numerische Schätzung der Gewebetemperatur am lokalen Maximum von (i) dem geometrischen akustischen Fokus, (ii) dem Gehirngewebe, das die der einfallenden Beschallung zugewandte Schädeloberfläche berührt, und (iii) der Schnittstelle zwischen Gehirn und Schädelbasis.

Wir haben auch eine Elektrophorese an den beiden fluoreszierenden Tracern durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Ultraschallbehandlung ihre MW-Verteilungen verändern würde, da Dextran ein langkettiges Molekül ist. Das OA mit kleinerem Molekulargewicht eluierte weiter als FITC-d, wobei der größte Teil der FITC-d-Fluoreszenz in der Vertiefung verblieb (Abb. 4b; Gelelution in voller Länge, dargestellt in der ergänzenden Abb. S4). Ein Teil der Fluoreszenz von FITC-d wurde in einem größeren Abstand (9,5 ± 0,3 mm; n = 16) im Vergleich zum Elutionsabstand des 45 kDa OA (8,9 ± 0,2 mm, dargestellt als „Spur“; einseitig) nachgewiesen t-Test, n = 16, P < 0,001), was darauf hinwies, dass FITC-d Dextranmoleküle enthielt, die kleiner als 2000 kDa waren. Dennoch gab es keinen Unterschied im Elutionsabstand zwischen den FUS−- und FUS+-Bedingungen für beide Tracer (FITC-d, FUS-: FUS+ = 9,5 ± 0,3: 9,5 ± 0,3 mm; OA, FUS−: FUS+ = 8,9 ±). 0,2: 8,8 ± 0,2 mm, n = 8 pro Gruppe, zweiseitiger t-Test, alle P > 0,7), was darauf hinweist, dass die Ultraschallbehandlung ihr MW nicht verändert hat.

Die numerische Simulation wurde unter Verwendung von Daten der Computertomographie (CT) des Rattenschädels (n = 3) in zwei Schritten durchgeführt: (1) um die akustische Intensitätsverteilung in situ durch Modellierung der Ausbreitung akustischer Wellen in der Schädelhöhle der Ratte abzuschätzen und (2) um die Temperatur des Gehirngewebes und der Schädel-Hirn-Grenzflächen durch Lösen der Biowärmeübertragungsgleichung zu bewerten. Die simulierten räumlichen Verteilungen der akustischen Intensität, die von einem Nagetierschädel erhalten wurden, sind in den Dreiebenenabschnitten entlang des Beschallungspfads dargestellt (Abb. 4c). Zusätzlich zum geometrischen Fokusbereich an der Injektionsstelle (ISPPA 4,4 ± 0,2 W/cm2, Spitze-zu-Spitze-Druck von 679,6 ± 23,1 kPa, dargestellt in Abb. 4c-i) identifizierten wir zusätzliche lokale Intensitätsmaxima bei an der Schädeloberfläche, die den einfallenden FUS-Wellen zugewandt ist (ISPPA 4,5 ± 0,4 W/cm2, Spitzendruck von 698,1 ± 61,9 kPa, in Abb. 4c-ii) und am Gehirngewebe, das an die Schädelbasis angrenzt (ISPPA 4,7 ± 0,4). W/cm2, Spitze-zu-Spitze-Druck von 722,2 ± 57,1 kPa, in Abb. 4c-iii, Simulationsergebnisse in ergänzender Abb. S5). Die Bildung zusätzlicher lokaler Maxima, die zu etwas höheren Intensitäten in der Nähe der Schädelschnittstellen führten, war auf akustischen Nachhall zurückzuführen, der mit der geringen Größe des Rattenschädels im Vergleich zur Wellenlänge des Ultraschalls (λ = ~ 7 mm in Wasser) verbunden ist35. Die thermische Analyse dieser lokalen Maxima zeigte trotz der konservativen Überschätzung der Wärmedeposition nur einen leichten Anstieg von < 0,027 °C und erreichte innerhalb von 7 Minuten (404 s) nach der Beschallung ein stationäres Maximum (Abb. 4d).

Durch eine umfassende histologische Analyse wurde bereits gezeigt, dass die in der vorliegenden Studie verwendeten Beschallungsparameter keine Schädigung des Gehirngewebes verursachen28; Dennoch untersuchten wir die Auswirkungen einer einstündigen Beschallung, die auf dieselbe Koordinate der Tracer-Injektion angewendet wurde (jedoch ohne Durchführung einer Injektion), bei zwei männlichen SD-Ratten (mit einem Gewicht von 270 und 275 g). Das Verhalten der Tiere wurde während der einwöchigen Überlebenszeit überwacht (20-minütige Beobachtung jeden zweiten Tag). Beide Tiere zeigten normales Verhalten und die histologische Analyse der beschallten Hirnregionen ergab keine Anzeichen einer Gewebeschädigung (beispielhafte Daten in Abb. 5) im Hinblick auf die globale Gewebeintegrität/Blutungen (durch Hämatoxylin und Eosin [H&E]). apoptotische Aktivität (über Caspase-3-Immunhistochemie [IHC]-Färbung), ischämische Schädigung (über Vanadiumsäurefuchsin [VAF]-Toluidinblau) und Glia-Infiltrationen (über Glia-fibrilläres saures Protein [GFAP]-Färbung).

Exemplarische Histologie des Hirngewebes. Obere Reihe: Mit H&E, Caspase-3, VAF-Toluidinblau und GFAP (von links nach rechts) gefärbte mikroskopische Bilder von beschallten Hirnschnitten. Balken = 2 mm, untere Reihe: vergrößerte Bilder des beschallten Hirngewebes (umgeben von den gepunkteten Rechtecken). Balken = 0,5 mm L = links; R = richtig.

Es liegen immer mehr Beweise vor, die den Zusammenhang zwischen einer abnormalen Clearance gelöster Stoffe im Gehirn und verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie den Folgen einer traumatischen Hirnverletzung36,37, idiopathischem Normaldruckhydrozephalus38, Schlaganfall39 und Neurodegeneration40 belegen. Nicht-invasive Maßnahmen zur Verbesserung des Transports gelöster Stoffe aus dem Gehirnparenchym können neue therapeutische Möglichkeiten bieten, indem sie die Beseitigung unerwünschter Abfallstoffe aus dem Gehirn verbessern. Ultraschallbeschallung in Kombination mit der intravenösen Verabreichung von Mikrobläschen-Kontrastmitteln (MB) öffnet vorübergehend die Blut-Hirn-Schranke und ermöglicht so die Abgabe von Makromolekülen durch die Blut-Hirn-Schranke für verschiedene therapeutische Zwecke27,41. Es hat sich auch gezeigt, dass die Technik den interstitiellen Wassertransport fördert, der durch die Hochregulierung der AQP4-Expression42 oder der Amyloid-Beta-Clearance (Aβ) vom Hirnparenchym zum Liquor in Tiermodellen vermittelt wird43. Trotz seines vielversprechenden Potenzials zur Verbesserung der Clearance gelöster Stoffe aus dem Gehirn birgt die gleichzeitige Anwendung von MB-FUS das Risiko einer lokalen Blutung durch übermäßige BHS-Störung, die durch Trägheitskavitation verursacht wird44,45. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass die transkranielle Anwendung von FUS, verabreicht bei einem Druckniveau, das keine Störung der BHS verursacht (Spitzen-zu-Spitze-Amplitude von 770 kPa)28 ohne Verwendung von MB, nicht nur den Transport von intrakortikal injiziertem Fluoreszenzmittel fördert Tracer, erleichterte aber auch deren Clearance aus dem Gehirn.

Beim Vergleich der Verteilungsvolumina zwischen OA und FITC-d im Rattenhirn stellten wir fest, dass OA mit kleinerem Molekulargewicht weiter transportiert wurde als FITC-d mit höherem Molekulargewicht, unabhängig von der Anwesenheit von FUS. Dieser Befund stimmt mit der vorherigen Beobachtung überein, dass der Transport interstitieller gelöster Stoffe größenabhängig ist11. Interessanterweise könnte diese Abhängigkeit darauf hindeuten, dass beim interstitiellen Transport gelöster Stoffe eine Diffusionskomponente vorhanden ist, die mit dem konvektiven Transport vermischt ist46,47. Eine Debatte über die vorherrschende Art des Transports gelöster Stoffe innerhalb des „echten“ interstitiellen Raums (im Gegensatz zu neurovaskulären Strukturen, einschließlich des PVS) zwischen Advektion (die den konvektiven Fluss begleitet) und Diffusion ist noch nicht geklärt, und unsere Beobachtung könnte auf den Beitrag hinweisen zwei Arten des Transports gelöster Stoffe, die im Einklang arbeiten.

Eine schichtweise Untersuchung der Tracerverteilung im Gehirn ergab, dass FUS den Transport von OA und FITC-d verstärkte und eine höhere Tracerverteilung von der Injektionsstelle in rostraler Richtung zeigte. Dies weist auf das Vorhandensein eines anisotropen interstitiellen/CSF-Transports gelöster Stoffe hin. Die Ergebnisse unterschieden sich jedoch von der kaudalen Abweichung, die beim Transport gelöster Stoffe berichtet wurde, was durch die Bewegung von Gadolinium-Immunglobulin bei intrathekaler hyperosmolarer Mannitol-Koinfusion48 oder intraparenchymalem Evans-Blau-Farbstoff bei Nagetieren49 gezeigt wurde. Wir gehen davon aus, dass die Nadelschräge, die während der Injektion in rostraler Richtung ausgerichtet war, möglicherweise zu einer räumlichen Verzerrung beim Transport geführt hat. Wahrscheinlich ist jedoch auch der Beitrag der nasalen lymphatischen Clearance-Pfade des Gehirns, die rostral zum Gehirn verlaufen, wahrscheinlich50,51. Es ist auch bemerkenswert, dass die Verstärkung des Tracertransports radial von der Injektionsstelle aus erfolgte und nicht entlang der Richtung der Wellenausbreitung (d. h. in ventraler Richtung), was Ähnlichkeiten mit der bei der durch Ultraschall unterstützten Konvektion verstärkten Abgabe (UCED) von aufwies Evans Blue-Farbstoff im Gehirn von Nagetieren52. Wir vermuten, dass eine anisotrope Anordnung des perivaskulären Raums, beispielsweise der Schnittstelle zwischen Kortex und Corpus callosum ventral der Injektionsstelle, die Richtungsabhängigkeit des Transports gelöster Stoffe verringert haben könnte. Das Vorhandensein eines intrakraniellen Nachhalls, wie aus unserer numerischen Simulation (Abb. 4c) hervorgeht, könnte auch zu einer verringerten Richtungsabhängigkeit des Transports entlang des Beschallungspfads beitragen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die genauen Wege und Richtungen der Lymphclearance des Gehirns über das gesamte Gehirnvolumen aufzudecken.

Wir stellen fest, dass die Ultraschallbehandlung in der vorliegenden Studie den Transport des intrakortikal injizierten FITC-d erheblich verbesserte. Dieser Befund stand im Gegensatz zu unserer vorherigen Beobachtung, dass der Transport von intrazisternal injiziertem CSF FITC-d durch FUS28 nicht beeinträchtigt wurde. Wir gehen davon aus, dass der Unterschied auf den lokalen Konzentrationsunterschied der Tracer zurückzuführen ist, die dem Beschallungspfad ausgesetzt waren, wobei die meisten der intrakortikal injizierten (also unverdünnten) FITC-d-Tracer direkt dem akustischen Druckfeld ausgesetzt waren und somit vom FUS zu a angetrieben wurden größere Entfernung als die intrazisternal injizierten Tracer, die mit dem Liquor deutlich verdünnt würden.

Um eine nachweisbare Clearance und anschließende Drainage der interstitiellen Tracer zu den cLNs zu ermöglichen, injizierten wir im zweiten Satz des Experiments eine größere Menge OA (20 µg) und verdoppelten die Beschallungszeit (auf 60 Minuten). Wie erwartet wurde OA im Vergleich zum ersten Experiment (Abb. 2B, D) weiter transportiert, mit der gleichen rostralen Richtungsverzerrung, die im ersten Abschnitt der Studie beobachtet wurde (Abb. 2E). Aus der Untersuchung der in die cLNs abgeleiteten OA ohne Ultraschallbehandlung (FUS−) ging hervor, dass die Seite der OA-Injektion keinen Einfluss auf die Clearance zu den cLNs hatte, wie die äquivalente OA-Aufnahme von beiden cLNs ipsilateral und kontralateral dazu zeigt Injektion. Die Anwendung von FUS führte jedoch zu einer deutlich höheren OA-Aufnahme in den cLNs, insbesondere im scLN ipsilateral zur Beschallung (Abb. 3).

Eine FUS-vermittelte Verbesserung der OA-Drainage war auch beim ipsilateralen dcLN erkennbar, während der prozentuale Anteil der Tracer-Fläche viel geringer war als der der scLNs. Diese bevorzugte Drainage von OA zum scLN hatte Ähnlichkeit mit einer früheren Arbeit, in der die Bewegung des Evans-Blau-Farbstoffs untersucht wurde, die nach der Injektion in das Striatum bei Mäusen beobachtet wurde49. Dieser Befund unterschied sich jedoch von anderen Studien, die den bevorzugten Weg der dcLN-Clearance interstitieller Tracer und exogener Immunzellen (T-Zellen) über ein Netzwerk duraler Lymphgefäße gezeigt haben53,54. Was die Ursache für diese Diskrepanz betrifft, vermuten wir, dass OA, verteilt mit der räumlichen Ausrichtung zum rostralen Teil des Gehirns, überwiegend durch das nasale Lymphsystem transportiert wurde und eine größere Konnektivität zum scLN als zum dcLN50 aufweist. Ein Teil der interstitiellen OA wird zum Pialoberflächengefäßsystem transportiert (sichtbar in Abb. 2C) und in angrenzenden Dural-Lymphgefäßen, wie den mittleren Meningealarterien, gesammelt53,55 und dann zum dcLN abgeleitet, wenn auch in geringerem Maße als scLNs .

Darüber hinaus fanden wir große gruppeninterne Unterschiede in der OA-Drainage zum cLN (Abb. 3), insbesondere im dcLN, wo bei einigen Tieren keine Fluoreszenz festgestellt wurde. Die Zeit zwischen der Tracer-Injektion und der Organentnahme wurde bei allen Tieren und in der Gruppe eingehalten; Daher hätte die Tracer-Sammelzeit bei den beobachteten Variationen keine große Rolle gespielt. Obwohl wir die Ursachen für diesen Befund nicht ermitteln können, vermuten wir, dass individuelle Variationen in der Effizienz des Transports gelöster Stoffe im Gehirn (z. B. durch glymphatischen und/oder periarteriellen Transport) zu unterschiedlichen Transitzeiten gelöster Stoffe zu den cLNs geführt haben könnten. Eine längere Wartezeit (als in der vorliegenden Studie verwendet 1 Stunde) kann schließlich die Sammlung von Tracern für alle Tiere ermöglichen. Da wir den Beitrag anderer Wege der Clearance gelöster Stoffe (z. B. Drainage zum meningealen venösen Sinus über Arachnoidalgranulationen oder den Plexus choroideus) nicht vollständig ausschließen können, sind weitere Studien erforderlich, um die detaillierten Lymphaustrittswege zu verstehen, beispielsweise anhand großer Tiermodelle ( (z. B. Schwein oder Schaf), die stärker sichtbare meningeale Arachnoidalgranulationen aufweisen. Studien an großen Tieren sind ebenfalls attraktiv, da deren größere Schädeldimensionen den Beitrag des akustischen Nachhalls, der in der vorliegenden Studie beobachtet wurde, deutlich reduzieren würden.

Unseres Wissens stellen die vorliegenden Ergebnisse den ersten Beweis dafür dar, dass die gepulste Anwendung von FUS nicht nur den Transport, sondern auch die Clearance interstitieller gelöster Stoffe im Gehirn regional verbessern kann. Das MW des in dieser Arbeit verwendeten OA war vergleichbar mit dem von neuroreaktiven Aβ-Oligomeren (~ 8–70 kDa)56, und der erhöhte Grad der OA-Drainage lässt auf ein vielversprechendes zukünftiges therapeutisches Potenzial von tFUS bei der Entfernung von Aβ schließen. Es wurde festgestellt, dass die Herzfrequenz, die die PVS-Pulsation (und den damit verbundenen Transport gelöster Stoffe) beeinflussen kann, sowie andere Vitalparameter wie Atemfrequenz und SpO2, die die Tiefe der Anästhesie widerspiegeln, bei allen Bedingungen gleichgültig war, was darauf hindeutet, dass unsere Ergebnisse nicht durch diese Faktoren verfälscht wurden diese physiologischen Variablen. Durch numerische Simulation der akustischen Ausbreitung und thermische Analyse (Abb. 4c, d) stellten wir fest, dass die Anwendung von FUS aufgrund der geringen Intensität das Gehirngewebe nicht erwärmen würde. Obwohl wir postulieren, dass die durch gepulste FUS vermittelte akustische Strömung die Hauptantriebskraft für den verbesserten Transport und die Clearance interstitieller gelöster Stoffe war, bleibt der zugrunde liegende Mechanismus unklar, da das Vorhandensein akustischer Dispersion und komplexer akustischer Wechselwirkungen mit poroelastischem Hirngewebe ebenfalls dazu beitragen können zur advektiven Bewegung gelöster Stoffe52. die anschließend von den meningealen Lymphgefäßen und den nasalen Lymphgefäßen gesammelt werden.

Wir stellen außerdem fest, dass eine gewisse mikroskopische Störung zwischen dem PVS und dem Neuropil, die während der direkten Tracer-Injektion vorliegt, dazu führen kann, dass ein Teil der Tracer in das PVS austritt (und folglich durch FUS transportiert wird). Obwohl die intrakortikale Injektionstechnik bei der Untersuchung der Bewegung interstitieller gelöster Stoffe weit verbreitet ist, kann eine Schädigung der Gliazellen, die mit der Nadelinjektion einhergehen kann, auch die Funktion des AQP4-Kanals akut reduzieren49 und so den Tracertransport verringern. Experimente an Tieren, bei denen keine Injektion exogener Tracer erforderlich ist, beispielsweise an einem Nagetier-AD-Modell, und die anschließende Quantifizierung der FUS-vermittelten Drainage endogener Aβ-Proteine ​​(erreichbar durch Positronenemissionstomographie), könnten den Beitrag dieser Störfaktoren untersuchen.

Die in dieser Arbeit verwendeten FUS-Parameter, dh 100 ms PD bei 1 Hz PRF, veränderten die EEG-Gehirnaktivität nicht (Abb. 4a). Dies steht im Einklang mit Hinweisen auf eine ineffiziente Hirnstimulation im Zusammenhang mit der Verwendung einer langen akustischen Impulsdauer57. Es kann jedoch zu einer durch Ultraschall induzierten neuronalen Aktivität auf Zellebene kommen, die sich anschließend auf die Clearance gelöster Stoffe im Gehirn auswirken kann. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Ultraschallbehandlung selbst das Ausmaß der AQP4-Expression verändert hat, was sich auf den interstitiellen Wassertransport auswirkt58. Daher würde die Beurteilung der Funktion/Expression von AQP4 oder neuronaler Aktivität (z. B. c-Fos), die von FUS beeinflusst wird, auf Zellebene weitere Einblicke in den zugrunde liegenden Mechanismus unserer Beobachtung bieten.

Wir erkennen an, dass auch eine Optimierung der Beschallungsparameter erforderlich ist, um die Wirkung von FUS bei möglichst geringer akustischer Intensität (und Druckamplituden) zu maximieren. Beispielsweise kann eine höhere Frequenz als die in dieser Studie verwendete (dh 200 kHz) verwendet werden, um den Transport bei gleichem Druckniveau zu verbessern. In-vitro-Experimente zur Farbstoffinfiltration in einem porösen Medium wie hydrophilem Polyvinylalkohol (PVA)-Schaum (durchschnittliche Porengröße 80 µm), der poröse Mikrostrukturen besitzt, die das PVS (röhrenförmiges PVS mit einem Durchmesser von ~ 40 µm entlang jeder Seite der Arterienwand) annähernd nachahmen19) können zur Optimierung der Beschallungsparameter vor weiteren In-vivo-Anwendungen verwendet werden. In diesem Zusammenhang kann zusätzlich eine numerische Modellierung des durch FUS beeinflussten Tracerverhaltens angestrebt werden, um die interstitielle Bewegung gelöster Stoffe abzuschätzen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das akustische Strömungsverhalten stark nichtlinear ist und von den Beschallungsparametern und der Mikrostruktur des porösen Mediums abhängt59. Beispielsweise ist die Eckart-Strömung in Strukturen vorherrschend, die größer als die Wellenlänge des Ultraschalls sind, während die Rayleigh-Strömung in Strukturen kleiner als die Wellenlänge des Ultraschalls vorherrschend ist60. Da die detaillierte Zytoarchitektur des Gehirns, einschließlich des PVS, noch unbekannt ist, wäre die numerische Vorhersage realistischer Fluidbewegungen (einschließlich der Bewegung gelöster Stoffe) im Gehirn äußerst anspruchsvoll, stellt jedoch einen Gegenstand für zukünftige Untersuchungen dar.

In Bezug auf die experimentelle Technik, die eine Wartezeit von 30 Minuten nach der Tracer-Injektion vor der Anwendung von FUS beinhaltete, haben wir zuvor berichtet, dass die gleiche Intensität von FUS auf das Rattenhirn angewendet wurde, kurze Zeit (z. B. 7 Minuten) nach der intrakortikalen Anwendung Die Injektion interstitieller Tracer verursachte bei einem erheblichen Teil der getesteten Tiere massive intrakranielle Blutungen61. Allerdings haben wir im vorliegenden Versuchsprotokoll keine Blutungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die längere Wartezeit von 30 Minuten vor der Beschallung es der beeinträchtigten zerebrovaskulären Struktur (verursacht durch die Nadelinjektion) ermöglichte, sich zu schließen und so eine Blutung zu verhindern.

Wir stellen mehrere technische Einschränkungen unseres Ansatzes fest. Die Fixierungsmethode (d. h. PFA-Perfusion) gilt zwar als Goldstandard bei der Gewebefixierung, reduziert aber bekanntermaßen das PVS19-Volumen und kann somit den beobachteten Fluoreszenzpegel im Hirngewebe verringern. Trotz dieser Einschränkung würde die in allen Versuchsgruppen einheitlich verwendete PFA-Perfusion die beobachteten Effekte von FUS bei der Verbesserung des Transports und der Clearance gelöster Stoffe im Gehirn nicht verändern. Als Alternative kann eine Tauchfixierung in Betracht gezogen werden; Allerdings kann die lange Fixierungszeit, die für das relativ große Rattengehirn (im Vergleich zum Mausgehirn) erforderlich ist,62 zu noch mehr unerwünschten Artefakten führen, während die Auswirkung der Immersionsfixierung auf das Lymphsystem des Gehirns noch nicht vollständig geklärt ist. Daher ist der Einsatz bildgebender Verfahren wie der In-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie während der Ultraschallbehandlung dringend erwünscht, um die Bewegung/Verteilung interstitieller Tracer in lebenden Tieren zu überwachen19. Wir erkennen auch an, dass die aktuelle Studie nur an männlichen Ratten durchgeführt wurde, was Experimente an weiblichen Ratten erfordert, um geschlechtsspezifische Unterschiede der FUS-Effekte zu untersuchen, da kürzlich eine geschlechtsabhängige Architektur der meningealen Lymphgefäße beim Menschen festgestellt wurde63.

Ein effizienter interstitieller Transport gelöster Stoffe und die lymphatische Beseitigung unerwünschter Stoffwechselabfälle aus dem Gehirn sind für die normale Gehirnfunktion von entscheidender Bedeutung. Wir haben gezeigt, dass die transkranielle Anwendung von FUS nicht-invasiv die Bewegung und Drainage intrakortikal injizierter gelöster Stoffe bei Ratten fördert. Beim Menschen wäre der Gehirnbereich, der die Abfallbeseitigung erfordert, nicht auf eine einzige Stelle beschränkt, zum Beispiel zeigen relativ große Bereiche in neokortikalen Regionen eine erhöhte Aβ-Belastung während der präklinischen Phase von AD64. Unter Berücksichtigung einer möglichen Anwendung beim Menschen sollte daher ein FUS-System und ein Wandlerdesign von einem traditionellen Mittel einer einzelnen fokalen Abgabe akustischer Wellen abweichen und stattdessen die Beschallung breiter und unregelmäßiger Formen des interessierenden Gehirnvolumens ermöglichen. Eine elektronische Steuerung des FUS-Strahls/Fokus ist mit der Phased-Array-Wandlerkonfiguration65 möglich, alternativ ist jedoch auch eine einfachere mechanische Steuerung des Ultraschalls denkbar. Darüber hinaus können auch 3D-gedruckte akustische Linsen, die mit einem Piezomaterial gekoppelt sind, zur Beschallung in der gewünschten Form verwendet werden, die ein viel größeres Volumen abdeckt66. Da die Beseitigung von Gehirnabfällen möglicherweise mehrere FUS-Sitzungen erfordert, wird die Ergonomie des Schallkopfdesigns für den Patientenkomfort zu einem wichtigen Faktor. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Verständnis der detaillierten Mechanismen der Abfallbeseitigung aus dem Gehirn zwar intensive zukünftige Untersuchungen erfordert, FUS jedoch mit der Fähigkeit, die CSF-/interstitielle Bewegung gelöster Stoffe regional zu erleichtern, über das dringend benötigte nicht-invasive Potenzial für eine kontrollierte Verbesserung des Abfalltransports, einschließlich der Beseitigung, verfügt aus dem Gehirn.

Als interstitielle Fluoreszenztracer wurden 45 kDa-MW Texas Red OA (Thermo Fisher) und 2000 kDa-MW FITC-d (Millipore Sigma) verwendet. Da OA dazu neigt, in einer FITC-d-Lösung zu aggregieren, wurden die Tracer separat hergestellt, wobei jeder in einer Konzentration von 0,5 Gew.-% in künstlichem CSF (aCSF; Tocris Bioscience) vorliegt. Im zweiten Experiment zur Beurteilung des Grades der Clearance gelöster Hirnsubstanzen zu den cLNs wurde nur OA verwendet, da die Clearance von FITC-d mit großem MW zu den cLNs während eines Versuchszeitraums von ca. 2 Stunden minimal ist. Um die Nachweisempfindlichkeit der in die cLNs abgeleiteten OA zu erhöhen, wurde OA in einer erhöhten Konzentration (1 Gew.-%) in aCSF hergestellt.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women's Hospital genehmigt und in voller Übereinstimmung mit dessen Vorschriften und Standards durchgeführt. Alle Methoden werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) gemeldet. Sprague-Dawley (SD)-Ratten (alle männlich, n = 46) wurden gemeinschaftlich gehalten (zwei Ratten/Käfig) in einem 12-Stunden-/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus (Licht um 7 Uhr morgens an, um 19 Uhr aus) und durften Zugang zu Nahrung und Wasser nach Belieben. Die Ratten wurden durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung aus 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin anästhesiert. Nachdem eine ausreichende Narkosetiefe erreicht war, wurde der Kopf des Tieres mit einer Haarschneidemaschine und Enthaarungslotion rasiert. Das Tier wurde dann auf einen stereotaktischen Rahmen (ASI Instruments) gelegt, während ein 37 °C warmes Wärmekissen (Gaymar) unter das Tier gelegt wurde, um seine Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Die Anästhesieebene wurde alle 10 Minuten durch Überprüfung des Zehenklemmreflexes beurteilt. Bei Bedarf wurden zusätzliche Anästhesiedosen (jeweils 1/3–1/2 Dosis) verabreicht. Atem- und Herzfrequenz sowie die Sauerstoffversorgung des peripheren Blutes (SpO2), gemessen mit einem Pulsoximeter (Smiths Medical), wurden unmittelbar vor der Anwendung von FUS (oder dem Beginn der Kontrollbedingung) und alle 15 Minuten bis zum Ende der Beschallung aufgezeichnet .

Die vorbereitete Tracerlösung wurde auf der Grundlage etablierter chirurgischer Protokolle4,7 intrakortikal injiziert. Nach präventiver Verabreichung von 2 % Lidocainhydrochlorid unter die Haut in der Nähe des Einschnitts wurde ein Schnitt in der Mittellinie vorgenommen, um den Schädel freizulegen und das Bregma zu identifizieren. Es wurde ein Schädelbohrloch gebohrt (Fine Science Tools) 3 mm lateral und 1 mm kaudal des Bregma, ohne die Dura zu durchstechen. Dann wurde eine 30-Gauge-Nadel (30G) (0,1 ml, Hamilton) stereotaktisch 2 mm tief mit einer Geschwindigkeit von 2 mm/min eingeführt. Die Richtung der Nadelschräge war unter allen Versuchsbedingungen der rostralen Richtung zugewandt. Mit einer Spritzenpumpe (KD Scientific) wurden Tracer 2 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 0,25 µL/min injiziert (ein Gesamtvolumen von 0,5 µL). Nach einer Wartezeit von 5 Minuten wurde die Nadel 4 Minuten lang mit 0,5 mm/Minute zurückgezogen. In dem Experiment, das die Wirkung von FUS auf die Drainage von OA zu den cLNs untersuchte, wurden 2,0 µL Tracerlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,25 µL/Min. für 8 Minuten injiziert, wobei die Seite der Injektion (linke oder rechte Hemisphäre) randomisiert wurde und ausgeglichen über die Tiere hinweg.

Ein FUS-Wandler (Ultran Group), der mit einer Grundfrequenz von 200 kHz arbeitet, wurde durch eine sinusförmige elektrische Wellenform von einem Funktionsgenerator (Keysight) betätigt, der an einen linearen 40-Watt-Leistungsverstärker (Electronics and Innovations) angeschlossen war. Das räumliche Profil der Druckamplitude wurde direkt mit einer Schrittauflösung von 1 mm mithilfe eines Nadelhydrophons (Onda Corp.) kartiert, das auf einem 3-Achsen-Robotertisch in einem entgasten Wassertank montiert war, basierend auf einer an anderer Stelle ausführlich beschriebenen Methode33. Der Druck am akustischen Fokus wurde in Bezug auf die Eingangsspannung unter Verwendung eines kalibrierten Hydrophons (Onda Corp) kalibriert.

Das Tier wurde über einer selbst gebauten stereotaktischen Roboter-Beschallungsplattform (Newmark Systems) positioniert, die mit Ohr- und Beißstangen ausgestattet war. Die planare Bewegung des FUS-Wandlers, der an einem horizontalen Translationstisch befestigt war, wurde in Bezug auf die vertikal bewegliche Plattform, auf der das Tier platziert wurde, unabhängig gesteuert. Alle motorisierten Tische hatten eine räumliche Präzision von 15 µm. Vor der Beschallung wurde die Stelle der intrakortikalen Injektion mit einem chirurgischen Stift markiert, um den akustischen Pfad auf die Injektionsstelle auszurichten, und es wurde ein Abstand von ca. 8 mm zwischen der Kopfhaut und der Austrittsebene des Schallkopfs eingehalten, um den akustischen Fokus auf die Injektionsstelle zu legen Injektionsstelle (2 mm ventral von der Kopfhaut). Der Spalt zwischen dem Wandler und der Kopfhaut wurde mit einem komprimierbaren akustischen Kopplungsgel gefüllt, das mit einer 9 % w/v wässrigen Polyvinylalkohollösung (Millipore Sigma) hergestellt und durch zwei 16- bis 8-stündige Gefrier-Auftau-Zyklen geformt wurde. Auf alle Schnittstellen wurde akustisches Hydrogel (Parker Lab) aufgetragen.

Es wurde bereits festgestellt, dass FUS, das unmittelbar nach dem Zurückziehen der Nadel verabreicht wird, intrakranielle Blutungen verursacht61. Daher wurde nach dem Zurückziehen der Nadel eine Wartezeit von 30 Minuten eingeführt. Es hat sich auch gezeigt, dass die Wartezeit einen retrograden Ausfluss des Tracers verhindert67. Anschließend wurde FUS 30 Minuten lang stereotaktisch und gepulst an die Injektionsstelle abgegeben (n = 7 in jeder Gruppe). Die anderen sieben Tiere (in jeder Tracergruppe) erhielten keine Ultraschallbehandlung, was einen Kontrollzustand (dh „FUS-“-Zustand) darstellte. In dem Experiment, das die Wirkung von FUS auf die Clearance von intrakortikal injiziertem OA untersuchte, wurden die gleichen Ultraschallparameter (n = 8) 60 Minuten lang verabreicht, um die Zeit zu berücksichtigen, die für die nachweisbare Drainage des intrakortikalen Tracers zu den cLNs erforderlich ist. Acht Ratten wurden dem gleichen Verfahren unterzogen, ohne eine Ultraschallbehandlung zu erhalten („FUS−“-Bedingung).

Unmittelbar nach einer FUS-Sitzung (einschließlich der Nichtbeschallungsbedingung in den Kontrollgruppen) wurde eine Autopsie durchgeführt, um das Gehirn des Tieres durch transkardiale Perfusion von 4 % Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Boston Bioproducts) zu entnehmen. Die Zeit zwischen der Tracer-Injektion und dem Abschluss der transkardialen Perfusion (~ 30 Minuten) wurde bei allen Tieren eingehalten. Das extrahierte Gewebe wurde einer zusätzlichen 24-stündigen Tauchfixierung in PFA unterzogen. Im zweiten Experiment, das die Auswirkungen von FUS auf die OA-Drainage untersuchte, wurden sowohl dcLN als auch scLN entfernt. Das Gehirn wurde in einen 6 mm breiten Block geschnitten, der den akustischen Fokus umfasste, und mit einem Vibratom (Ted Pella) in rostral-kaudaler Richtung weiter in 200 µm dicke Scheiben geschnitten. Die geschnittenen Schnitte, die dorsale Gehirnoberfläche und die Lymphknoten wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop (Nikon) unter Verwendung eines Ultraweitfeld-CMOS-Sensors (23,4 mm × 15,6 mm) (Auflösung 4592 px × 3056 px, Sony) abgebildet. In der zweiten Versuchsreihe wurde auch die laterale Oberfläche des Gehirns von einigen Ratten abgebildet (n = 5:5, FUS + : FUS−), um das Muster der OA-Tracer-Verteilung über das Gefäßsystem der lateralen Pialoberfläche zu visualisieren. Alle Bilder wurden durch Farbkanäle in 8-Bit-Bilder aufgeteilt und die resultierenden Graustufenbilder mit entsprechender Fluoreszenzemission wurden für die anschließende Analyse verwendet.

Um das Tracervolumen (sowohl OA als auch FITC-d) aus jedem Vibratomschnitt abzuschätzen, wurde die Position der von jedem Tier erhaltenen Schnittbilder in Bezug auf die Injektionsstelle (bezeichnet als 0 mm) ausgerichtet und auf einen Schwellenwert von mehr als dem Dreifachen der mittleren absoluten Abweichung festgelegt von Intensitätsverteilungen, um die Pixel abzugrenzen, die die Traceraufnahme zeigen. Das Volumen der Traceraufnahme in jedem Abschnitt wurde dann aus der Anzahl der abgegrenzten Pixel abgeleitet (Bildpixel = 4,33 pL). Der Bereich der OA-Verteilung in den Rückenoberflächenbildern des Gehirns wurde anhand des Mittelwerts der automatischen Schwellenwerte (der in ImageJ68 implementierte Isodatenalgorithmus) segmentiert, der auf die Bilder aus der FUS + -Gruppe angewendet wurde. Um die prozentuale Fläche der OA-Aufnahme in die cLNs zu berechnen, wurden beide extrahierten cLNs zur Bildgebung unter das gleiche Sichtfeld des Mikroskops gestellt. Um die geringere Fluoreszenz als die Bilder der Gehirnoberfläche zu berücksichtigen, wurde der Bereich der OA-Aufnahme in den cLNs segmentiert, wobei 50 % über dem automatischen Schwellenwert vom Bild ipsilateral zur OA-Injektion verwendet wurden. Die von den cLNs eingenommene Fläche wurde aus dem Hellfeldbild (21,6 µm2/Pixel) segmentiert.

Um das elektrische Artefakt zu minimieren, das mit dem proximalen Kontakt mit dem Schallkopf verbunden ist (d. h. der Schallkopf könnte während der gepulsten Beschallung als Kondensator gewirkt und ein Spitzenartefakt erzeugt haben), wurde die Beschallung mit unserer vorherigen Technik ventral durch den Hals an das Gehirn abgegeben28. Zwei subdermale Draht-EEG-Elektroden (Ives EEG Solutions) wurden mit einem Abstand von ca. 10 mm unter der Mittellinie der Haut über der Kopfhaut eingeführt, und eine Erdungselektrode wurde an einem Ohr befestigt. Das EEG wurde jede Sekunde 300 Mal zeitgesteuert gemessen (Fenster von –100 bis 700 ms in Bezug auf den Beginn der Beschallung) und anschließend nach Anwendung eines 100-Hz-Tiefpass- und Netzfilters gemittelt. Das EEG wurde auch von demselben Tier ohne Ultraschallbehandlung erfasst, wobei die Reihenfolge der Kontroll- und Ultraschallbedingungen für die Tiere randomisiert war.

150 µL jeder Tracerlösung wurden im akustischen Fokus platziert (über einem dünnen Polyethylenterephthalatfilm für ununterbrochene akustische Übertragung; nominale Dicke von 13 µm, Absorption der akustischen Energie war durch Hydrophonmessung nicht nachweisbar) und unter Verwendung identischer Parameter wie denen, die dem gegeben wurden, beschallt Tiere. Das gleiche Tracervolumen wurde ohne Ultraschallbehandlung hergestellt, um eine Kontrollbedingung bereitzustellen. Unmittelbar nach der Ultraschallbehandlung wurden 10 µL sowohl beschallter als auch nicht beschallter Tracer (jeweils n = 8) in einer Pufferlösung (Volumenverhältnis 1:1 = normal) auf ein Agargel (Agarose mit niedriger Geliertemperatur, 0,8 Gew.-%, Sigma) geladen Kochsalzlösung: destilliertes Wasser) und wurden 25 Minuten lang einer Gelelektrophorese unterzogen (48 V konstante Spannung, Minipcr). Anschließend wurde die Elution fotografiert.

Informationen zur dreidimensionalen Geometrie von Schädeln wurden aus Ex-vivo-Rattenschädeln (n = 3; ohne Unterkieferknochen) mithilfe der Computertomographie (CT, Quelle 60 kV, Bruker) zur numerischen Simulation der akustischen Ausbreitung innerhalb des Schädels gewonnen. CT-Bilder wurden in isotropen Voxeln von 17 µm aufgenommen und auf Isovoxel von 0,25 µm umgerechnet, was ein Verhältnis von 30 Pixeln pro Wellenlänge in Wasser (λ = ~ 7,5 mm bei 200 kHz) ergab, um eine ausreichende räumliche Diskretisierung für die Simulation zu erreichen35. Die FUS-Quelle wurde basierend auf unserer vorherigen Methode69 entsprechend der Wandlergeometrie (Wandlerdurchmesser 28 mm und Krümmungsradius 22 mm) modelliert und entsprechend der im Tierversuch verwendeten Beschallungsgeometrie positioniert. Die linearisierte Westervelt-Lighthill-Gleichung zur Analyse der Ausbreitung akustischer Wellen wurde durch das numerische Schema der Finite-Differenzen-Zeitdomäne (FDTD) in einem Volumen gelöst, das sowohl den Wandler als auch den Schädel umfasste (183 × 275 × 266 Voxel), mit einer Zeitauflösung von 0,05 µs . Voxel im Bild wurden in Hounsfield-Einheiten (HU) ausgedrückt, die auf eine Wasserröhre im gleichen Bildvolumen kalibriert sind, und die akustischen Eigenschaften des Schädels (d. h. Schallgeschwindigkeit, Dichte und Dämpfung) wurden dabei verwendet Simulation, wie in unserer vorherigen Arbeit beschrieben69. Basierend auf der resultierenden räumlichen Verteilung der akustischen Intensität wurde anschließend die Biowärmeübertragungsgleichung mit der FDTD-Methode70 gelöst. Die zeitliche Temperaturänderung in den Medien wurde mit einer Zeitauflösung von 10 ms ermittelt, und die Beschallungsparameter (ISPPA von 5 W/cm2, 100 ms PD, 1 Hz PRF [d. h. 10 % Arbeitszyklus] und a Maximal 1 Stunde Beschallungsdauer) wurden bei der Schätzung unter der Annahme homogenen intrakraniellen Hirngewebes bei einer Anfangstemperatur von 37,5 °C verwendet. Thermische Eigenschaften des Gehirns (spezifische Wärmekapazität c von 3600 J/kg/K, Wärmeleitfähigkeit κ von 0,528 W/K/m), Schädel (c von 1300 J/kg/K, κ von 0,4 W/K/m) und Blutperfusion (c von 3620 J/kg/K, Perfusionsrate von 8,24 kg/m3/s und Dichte von 1030 kg/m3) wurden als Eingaben in der Simulation verwendet71. Alle Simulationen wurden in einer GPU-Umgebung (Graphic Processing Unit) mit paralleler Verarbeitung durchgeführt. Um den potenziellen Temperaturanstieg im Rattenhirngewebe konservativ zu überschätzen, wurden die Beiträge thermoregulatorischer Reaktionen und der CSF-Pulsation, die die Wärmeablagerung übertragen/entfernen72, nicht modelliert.

Eine statistische Analyse wurde mit der MATLAB-Software (Statistics and Machine Learning Toolbox, Mathworks) durchgeführt. Die Normalität und Sphärizität der Datenverteilung wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Normalitätstest bzw. dem Mauchly-Test untersucht. Der Kruskal-Wallis-H-Test wurde durchgeführt, um Unterschiede im Gewicht der Tiere zwischen den Gruppen zu untersuchen. Eine Analyse der Variablen mit wiederholten Messungen (ANOVA) wurde durchgeführt, um das Vorhandensein zeitabhängiger Veränderungen der Vitalfunktionen (Herz-/Atemfrequenz und SPO2) zwischen den Gruppen zu untersuchen, getrennt für die Art der Tracer. Zustandsspezifische Unterschiede in der Volumen-/Oberflächenverteilung und der prozentualen OA-Fläche in den Lymphknoten wurden mithilfe des Mann-Whitney-Tests und des Wilcoxon-Signed-Rank-Tests (hemisphärische Vergleiche innerhalb einer Gruppe) bewertet. Die Zeitreihen-EEG-Daten und der Tracer-Elutionsabstand von der Elektrophorese wurden mithilfe eines t-Tests bewertet. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt.

Ohne einen chirurgischen Eingriff für die Tracerinjektion durchzuführen, wurden zwei Ratten auf den stereotaktischen Rahmen gelegt und eine Stunde lang eine Ultraschallbehandlung an derselben Koordinate wie die Injektionsstelle in Bezug auf die interaurale Linie durchgeführt. Das Fell über dem Kopf wurde vor der FUS rasiert. Eine Woche später wurden die Ratten durch Ausbluten und anschließende transkardiale Perfusion (4 % Formaldehyd) getötet. Der beschallte Gehirnbereich wurde koronal geschnitten und mit H&E (GHS-2–16, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gefärbt, um Nekrose oder Blutung zu erkennen, und Caspase-3 IHC (ab4051, Abcam, Cambridge, UK), um Apoptose sichtbar zu machen Zellen, VAF-Toluidinblau (A3908, Sigma-Aldrich) zum Nachweis des Vorhandenseins ischämischer Schäden und GFAP (ab7260, Abcam) zum Nachweis von Glia-Infiltration, die mit Neuroinflammation verbunden sein kann. Die chromogene In-situ-Hybridisierung für IHC wurde unter Verwendung eines Bond-Polymer-Refine-Detektionskits (DS9800, Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) mit Citrat-Antigen-Retrieval basierend auf einem primären Antikörper-Verdünnungsfaktor von 1:300 für GFAP und 1:500 für Caspase durchgeführt. 3.

Alle Daten sind enthalten und werden in den Zusatzinformationen dargestellt. Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze werden kuratiert und im öffentlich zugänglichen Datenrepository von Harvard Dataverse gespeichert. https://dataverse.harvard.edu/dataset.xhtml?persistentId=doi:10.7910/DVN/GM0OI6

Da Mesquita, S. et al. Funktionelle Aspekte der meningealen Lymphgefäße im Alter und bei der Alzheimer-Krankheit. Natur 560, 185–191 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nedergaard, M. & Goldman, SA Glymphatisches Versagen als letzter gemeinsamer Weg zur Demenz. Wissenschaft 370, 50–56.

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Benveniste, H. et al. Das glymphatische System und die Abfallbeseitigung bei der Alterung des Gehirns: Ein Rückblick. Gerontologie 65, 106–119 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Kress, BT et al. Beeinträchtigung der paravaskulären Clearance-Wege im alternden Gehirn. Ann. Neurol. 76, 845–861 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P. & Joukal, M. Plexus choroideus und die Blut-Liquor-Schranke bei Krankheiten. Flüssigkeitsbarrieren CNS 17, 35 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Shetty, AK & Zanirati, G. Das interstitielle System des Gehirns bei Gesundheit und Krankheit. Alterungsdis. 11, 200–211 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Iliff, JJ et al. Ein paravaskulärer Weg erleichtert den Liquorfluss durch das Hirnparenchym und die Clearance interstitieller gelöster Stoffe, einschließlich Amyloid β. Wissenschaft. Übers. Med. 4(147), 147ra111. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3003748 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hladky, SB & Barrand, MA Mechanismen der Flüssigkeitsbewegung in, durch und aus dem Gehirn: Auswertung der Beweise. Flüssigkeitsbarrieren CNS 11, 26 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Da Mesquita, S., Fu, Z. & Kipnis, J. Das meningeale Lymphsystem: Ein neuer Akteur in der Neurophysiologie. Neuron 100, 375–388 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jessen, NA, Munk, AS, Lundgaard, I. & Nedergaard, M. Das glymphatische System: Ein Leitfaden für Anfänger. Neurochem. Res. 40, 2583–2599 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, AJ, Yao, X., Dix, JA, Jin, B.-J. & Verkman, AS Der Test der „glymphatischen“ Hypothese zeigt den diffusiven und Aquaporin-4-unabhängigen Transport gelöster Stoffe im Gehirnparenchym von Nagetieren. eLife 6, e27679. https://doi.org/10.7554/eLife.27679 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Holter, KE et al. Der interstitielle Transport gelöster Stoffe im 3D-rekonstruierten Neuropil erfolgt durch Diffusion und nicht durch Massenfluss. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 114, 9894–9899 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xie, L. et al. Schlaf treibt die Clearance von Metaboliten aus dem erwachsenen Gehirn voran. Wissenschaft 342, 373–377 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

von Holstein-Rathlou, S., Petersen, NC & Nedergaard, M. Freiwilliges Laufen verstärkt den glymphatischen Zustrom bei wachen, jungen Mäusen. Neurosci. Lette. 662, 253–258 (2018).

Artikel Google Scholar

Hadaczek, P. et al. Die durch arterielle Pulsation angetriebene „perivaskuläre Pumpe“ ist ein leistungsstarker Mechanismus für die Verteilung therapeutischer Moleküle im Gehirn. Mol. Dort. 14, 69–78 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Thomas, JH Fluiddynamik des Liquorflusses in perivaskulären Räumen. JR Soc. Schnittstelle 16, 20190572 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vinje, V., Eklund, A., Mardal, KA, Rognes, ME & Stoverud, KH Die intrakranielle Druckerhöhung verändert die Liquor-Clearance-Wege. Flüssigkeitsbarrieren ZNS 17, 29 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, AJ, Akdemir, G., Wadhwa, M., Song, D. & Verkman, AS Die Anwendung fluoreszierender Dextrane auf die Gehirnoberfläche unter konstantem Druck zeigt eine AQP4-unabhängige Aufnahme gelöster Stoffe. J. Gen. Physiol. 153(8), e202112898. https://doi.org/10.1085/jgp.202112898 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mestre, H. et al. Der Fluss der Liquor cerebrospinalis wird durch arterielle Pulsationen angetrieben und ist bei Bluthochdruck reduziert. Nat. Komm. 9, 4878 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mano, Y. et al. Intraparenchymale Ultraschallanwendung und verbesserte Verteilung von Infusat mit konvektionsverstärkter Abgabe im Gehirn von Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten. J. Neurochirurg. 124, 1490–1500 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Lewis, GK Jr., Schulz, ZR, Pannullo, SC, Southard, TL & Olbricht, WL Ultraschallunterstützte konvektionsverstärkte Abgabe an das Gehirn in vivo mit einer neuartigen Wandlerkanülenanordnung: Laboruntersuchung. J. Neurochirurg. 117, 1128–1140 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Raghavan, R. Theorie der akustischen Strömung in weicher poröser Materie und ihre Anwendungen für die ultraschallverstärkte konvektive Abgabe. J. Ther. Ultraschall 6, 6 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hynynen, K. & Jones, RM Bildgesteuerte Ultraschall-Phased-Arrays sind eine bahnbrechende Technologie für die nicht-invasive Therapie. Physik. Med. Biol. 61, R206–R248 (2016).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, W., Weisholtz, DS, Strangman, GE & Yoo, SS Sicherheitsüberprüfung und Perspektiven der transkraniellen fokussierten Ultraschall-Hirnstimulation. Gehirn-NeuroRehabilit. 14, e4 (2021).

Artikel Google Scholar

Jagannathan, J. et al. Hochintensive fokussierte Ultraschallchirurgie des Gehirns: Teil 1 – eine historische Perspektive mit modernen Anwendungen. Neurochirurgie 64(2), 201–211. https://doi.org/10.1227/01.NEU.0000336766.18197.8E (2009).

Artikel PubMed Google Scholar

Darmani, G. et al. Nicht-invasive transkranielle Ultraschallstimulation zur Neuromodulation. Klin. Neurophysiol. 135, 51–73 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Burgess, A. & Hynynen, K. Arzneimittelabgabe über die Blut-Hirn-Schranke mittels fokussiertem Ultraschall. Expertenmeinung. Drogenlieferung 11, 711–721 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, SS et al. Verbesserung der Bewegung des Liquor-Tracers durch die Anwendung von gepulstem transkraniell fokussiertem Ultraschall. Wissenschaft. Rep. 12, 12940 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aryal, M. et al. Die nicht-invasive Ultraschallinduktion des Liquorflusses verbessert die intrathekale Arzneimittelabgabe. J. Control Release 349, 434–442 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lee, W. et al. Bildgesteuerter transkraniell fokussierter Ultraschall stimuliert den primären somatosensorischen Kortex des Menschen. Wissenschaft. Rep. 5, 8743 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Duck, FA Medizinische und nichtmedizinische Schutzstandards für Ultraschall und Infraschall. Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 176–191 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Hablitz, LM et al. Ein erhöhter glymphatischer Zustrom korreliert mit einer hohen EEG-Delta-Leistung und einer niedrigen Herzfrequenz bei Mäusen unter Narkose. Wissenschaft. Adv. 5, eaav5447 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, SS et al. Fokussierter Ultraschall moduliert die regionalspezifische Gehirnaktivität. Neuroimage 56, 1267–1275 (2011).

Artikel PubMed Google Scholar

Kim, HC et al. Transkraniell fokussierter Ultraschall moduliert die kortikale und thalamische motorische Aktivität bei wachen Schafen. Wissenschaft. Rep. 11, 19274 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Younan, Y. et al. Einfluss der Druckfeldverteilung bei der transkraniellen Ultraschall-Neurostimulation. Med. Physik. 40, 082902 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Iliff, JJ et al. Eine Beeinträchtigung der glymphatischen Bahnfunktion fördert die Tau-Pathologie nach einer traumatischen Hirnverletzung. J. Neurosci. 34, 16180–16193 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Piantino, J., Lim, MM, Newgard, CD & Iliff, J. Zusammenhang zwischen traumatischer Hirnverletzung, Schlafstörungen und posttraumatischen Kopfschmerzen: Eine mögliche Rolle für die Dysfunktion der glymphatischen Bahn. Curr. Schmerz-Kopfschmerz-Rep. 23, 62 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Ringstad, G., Vatnehol, SAS & Eide, PK Glymphatisches MRT bei idiopathischem Normaldruckhydrozephalus. Brain 140, 2691–2705 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gaberel, T. et al. Beeinträchtigte glymphatische Perfusion nach Schlaganfällen durch kontrastmittelverstärkte MRT aufgedeckt: Ein neues Ziel für die Fibrinolyse? Strich 45, 3092–3096 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kylkilahti, TM et al. Gehirnbereinigung erreichen und neurodegenerativen Erkrankungen vorbeugen – Eine glymphatische Perspektive. J. Cereb. Blutfluss-Metabol. 41, 2137–2149 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, KT, Wei, KC & Liu, HL Fokussierter Ultraschall kombiniert mit Mikrobläschen bei Anwendungen im Zentralnervensystem. Pharmazie 13, 1084 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, M., Seo, H., Choi, H., Lee, EH & Park, J. Lokalisierte Modifikation des Wassermolekültransports nach gezielter ultraschallinduzierter Störung der Blut-Hirn-Schranke im Gehirn von Ratten. Vorderseite. Neurosci. 15, 685977 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, Y. et al. Verbesserung der glymphatisch-lymphatischen Drainage von Beta-Amyloid durch fokussierten Ultraschall im Alzheimer-Krankheitsmodell. Wissenschaft. Rep. 10, 16144 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, Z. et al. Intrakranielle Trägheitskavitationsschwelle und Entstehung von thermischen Ablationsläsionen mittels MRT-gesteuerter 220-kHz-fokussierter Ultraschallchirurgie: Präklinische Untersuchung. J. Neurochirurg. 122, 152–161 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Yoon, K. et al. Lokalisierte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke im Schafmodell mittels bildgesteuertem transkraniell fokussiertem Ultraschall. Ultraschall Med. Biol. 45, 2391–2404 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Cserr, HF & Ostrach, LH Massenfluss interstitieller Flüssigkeit nach intrakranieller Injektion von blauem Dextran 2000. Exp. Neurol. 45, 50–60 (1974).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cserr, HF, Cooper, DN & Milhorat, TH Fluss der interstitiellen Gehirnflüssigkeit, angezeigt durch die Entfernung extrazellulärer Marker aus dem Schwanzkern der Ratte. Exp. Augenres. 25(Suppl), 461–473 (1977).

Artikel PubMed Google Scholar

Pizzo, ME et al. Intrathekale Antikörperverteilung im Rattengehirn: Oberflächendiffusion, perivaskulärer Transport und osmotische Verstärkung der Abgabe. J. Physiol. 596, 445–475 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pla, V. et al. Ein Echtzeit-In-vivo-Clearance-Assay zur Quantifizierung des glymphatischen Efflux. Cell Rep. 40, 111320 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kida, S., Pantazis, A. & Weller, RO Liquor fließt direkt aus dem Subarachnoidalraum in die Nasenlymphgefäße der Ratte. Anatomie, Histologie und immunologische Bedeutung. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 19, 480–488 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ma, Q., Ineichen, BV, Detmar, M. & Proulx, ST Der Abfluss von Liquor cerebrospinalis erfolgt überwiegend über Lymphgefäße und ist bei älteren Mäusen reduziert. Nat. Komm. 8, 1434 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lewis, GK Jr. et al. Zeitumkehrtechniken bei der ultraschallunterstützten konvektionsverstärkten Arzneimittelabgabe an das Gehirn: Technologieentwicklung und In-vivo-Bewertung. Proz. Lernen Sie Acoust kennen. 11, 20005–20031 (2011).

Artikel PubMed Google Scholar

Aspelund, A. et al. Ein durales Lymphgefäßsystem, das interstitielle Gehirnflüssigkeit und Makromoleküle ableitet. J. Exp. Med. 212, 991–999 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Louveau, A. et al. Strukturelle und funktionelle Merkmale der Lymphgefäße des Zentralnervensystems. Natur 523, 337–341 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ahn, JH et al. Meningeale Lymphgefäße an der Schädelbasis leiten Liquor ab. Natur 572, 62–66 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Yang, T., Li, S., Xu, H., Walsh, DM & Selkoe, DJ Große lösliche Oligomere des Amyloid-Beta-Proteins aus dem Alzheimer-Gehirn sind weitaus weniger neuroaktiv als die kleineren Oligomere, zu denen sie dissoziieren. J. Neurosci. 37, 152–163 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, H., Chiu, A., Lee, SD, Fischer, K. & Yoo, SS Fokussierte ultraschallvermittelte nicht-invasive Hirnstimulation: Untersuchung von Beschallungsparametern. Gehirnstimulation. 7, 748–756 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, T. et al. Wirkung von transkraniellem Ultraschall niedriger Intensität (LITUS) auf posttraumatische Hirnödeme bei Ratten: Bewertung durch isotrope dreidimensionale T2- und Multi-TE-T2-gewichtete MRT. Vorderseite. Neurol. 11, 578638 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J. Akustisches Streaming und seine Anwendungen. Flüssigkeiten 3, 18 (2018).

Artikel ADS Google Scholar

Ben Hadid, H., Dridi, W., Botton, V., Moudjed, B. & Henry, D. Instabilitäten im Rayleigh-Benard-Eckart-Problem. Physik. Rev. E Stat. Nichtlineare Physik der weichen Materie. 86, 016312 (2012).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Kim, E., Van Reet, J., Kim, HC, Kowsari, K. & Yoo, SS Hohe Inzidenz intrazerebraler Blutungen im Zusammenhang mit der Anwendung von fokussiertem Ultraschall geringer Intensität nach einer akuten zerebrovaskulären Verletzung durch intrakortikale Injektion. Pharmazie 14, 2120 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McFadden, WC et al. Perfusionsfixierung im Brain Banking: Eine systematische Übersicht. Acta Neuropathol. Komm. 7, 146 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Albayram, MS et al. Nicht-invasive MR-Bildgebung menschlicher Lymphnetzwerke im Gehirn mit Verbindungen zu zervikalen Lymphknoten. Nat. Komm. 13, 203 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hampel, H. et al. Der Amyloid-Beta-Signalweg bei der Alzheimer-Krankheit. Mol. Psychiatrie 26, 5481–5503 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hynynen, K. & Jolesz, FA Demonstration einer möglichen nicht-invasiven Ultraschall-Gehirntherapie durch einen intakten Schädel. Ultraschall Med. Biol. 24, 275–283 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Maimbourg, G., Houdouin, A., Deffieux, T., Tanter, M. & Aubry, JF 3D-gedruckte adaptive akustische Linse als bahnbrechende Technologie für die transkranielle Ultraschalltherapie mit Einzelelementwandlern. Physik. Med. Biol. 63, 025026 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Plog, BA et al. Biomarker traumatischer Verletzungen werden über das glymphatische System vom Gehirn ins Blut transportiert. J. Neurosci. 35, 518–526 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ridler, TW & Calvard, S. Bildschwellenwertbildung unter Verwendung einer iterativen Auswahlmethode. IEEE Trans. Syst. Mann Cybern. 8, 630–632 (1978).

Artikel Google Scholar

Yoon, K., Lee, W., Croce, P., Cammalleri, A. & Yoo, SS Multi-Resolution-Simulation der fokussierten Ultraschallausbreitung durch den Schädel von Schafen von einem Einzelelementwandler. Physik. Med. Biol. 63, 105001 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pennes, HH Analyse der Gewebe- und arteriellen Bluttemperaturen im ruhenden menschlichen Unterarm. 1948. J. Appl. Physiol. 85, 5–34 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Constans, C., Mateo, P., Tanter, M. & Aubry, JF Mögliche Auswirkungen thermischer Effekte während der Ultraschall-Neurostimulation: Retrospektive numerische Schätzung des Temperaturanstiegs in sieben Nagetier-Setups. Physik. Med. Biol. 63, 025003 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Sukstanskii, AL & Yablonskiy, DA Theoretisches Modell der Temperaturregulation im Gehirn bei Veränderungen der funktionellen Aktivität. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 103, 12144–12149 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Yongzhi Zhang für die erste Vorbereitung der Operationstechniken.

Abteilung für Radiologie, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 75 Francis Street, MA, 02115, Boston, USA

Seung-Shik Yoo, Evgenii Kim, Kavin Kowsari, Jared Van Reet und Hyun-Chul Kim

Abteilung für Künstliche Intelligenz, Kyungpook National University, Daegu, Republik Korea

Hyun-Chul Kim

School of Computational Science and Engineering, Yonsei University, Seoul, Republik Korea

Kyungho Yoon

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

SSY, EK und HCK waren am Studiendesign, der Gerätevorbereitung, der Datenerfassung und der Analyse beteiligt. KK und JVR beteiligten sich an der Datenerfassung. KY beteiligte sich an der Datenanalyse. Alle beteiligten sich an der Erstellung und Überprüfung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Seung-Schik Yoo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yoo, SS., Kim, E., Kowsari, K. et al. Nicht-invasive Verbesserung der intrakortikalen Clearance gelöster Stoffe durch transkraniellen fokussierten Ultraschall. Sci Rep 13, 12339 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39640-2

Zitat herunterladen

Eingegangen: 23. April 2023

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 31. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39640-2

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.